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第1章小鼠早期胚胎細胞的命運決定

YojiroYamanaka !AmyRalston

摘要：發育過程中，最初的胚胎全能干細胞特異性地形成獨立的組織胚層。小鼠中形成的及時胚系是胚外組織。同時，沒有成為胚外層的細胞仍保留多能干性，它們可以形成胚胎的所有胚層。多能干細胞系來源于胚胎的幾個發育階段。有趣的是，在同一時期胚外層已經有多能干細胞系了。因此，檢測早期胚胎細胞命運決定的調控是研究干細胞系建立的一個難得的機會。以往的研究為前三個胚層的形成提出了深刻的見解，而現代分子成像技術的運用進一步推動了這一領域的發展。本章我們將介紹目前所發現的小鼠發育過程早期三個胚層建立和維持的多樣的分子機制。

引言

在小鼠發育的初期，最初全能細胞的發育潛力是受到限制的，僅發育成小鼠及時胚層。而在非哺乳動物物種中，及時胚層的建立則可能涉及主體軸的形成，哺乳動物的不同在于其首先要完成著床。因此，幾天內胚胎和胚外組織之間的差異包括了前兩個胚層決定(圖1-1)及之前胚層(外胚層、中胚層、內胚層)和胚系的建立。這種獨特的哺乳動物發育模式涉及一種獨特的細胞類型，可以從中分離出來并擴增為穩定的細胞系。因此，認識胚外組織的起源有助于我們了解干細胞的形成與分化。以往的研究對前三個胚層的形成提出了頗具洞察力的見解，而利用現代分子生物學和成像技術將進一步推進這一領域的發展。

受精后第三天，小鼠胚胎(囊胚)包含三個組織系：外胚層(EPI)、滋養層(TE)和原始內胚層(PE)。對來源于這些胚層的干細胞系的分離和研究加深了我們對早期胚胎細胞命運決定的認識。已經從囊胚中分離得到三類干細胞系：胚胎干細胞、滋養層干細胞和胚外內胚層干細胞(ES細胞、TS細胞和XEN細胞)。它們均具有干細胞自我更新及分化為各類成熟細胞等的特性。同時，每種干細胞系仍保有與其來源相關的特性，包括組織特異性的發育潛力、形態、轉錄因子表達和生長因子需求\這些干細胞系的提出不僅為那些需要大量初始原料的研究提供了可擴增的純細胞群，也是了解干細胞起源的一個契機。

從胚胎干細胞的研究中我們可以對細胞命運選擇基因進行更深入的分子水平分析。

操控某一特定種系調節基因可以引起干細胞發生相應的命運改變。例如，一個滋養細胞轉錄因子Cdx2就足夠使ES細胞轉變成TS-樣的細胞2。這類研究表明ES細胞具有很強的可塑性，以及作為胚層決定因子Cdx2基因的核心作用。胚胎干細胞也為研究胚層決定基因之間的分子相互作用提供了一個機會，從而成為認識胚胎的細胞命運選擇的模式。然而，在胚層決定基因的研究中發現其發揮作用主要在相對晚期，因此便提出胚胎早期是如何決定三個胚層的疑問。

參與及時胚層形成的機制可能有很多種，包括細胞的位置、形狀、極化、信號和分裂面。在新提出的模式中，早期的前干細胞程序使組織胚層特異性形成囊胚。而在著床及以后，細胞命運則由干細胞系中的一個活化程序所掌控(圖1-2)。

胚層的建立和前干細胞程序：囊胚的形成

這里我們將討論胚層形成的及時個階段：TE和內細胞團(ICM)的形成共同組成囊胚。TE將分化為胎盤，而ICM是胚胎和原始內胚層祖細胞的混合物。在囊胚中，TE圍繞ICM和中空的囊胚腔，胚層示蹤實驗表明TE和ICM細胞群是從胚胎的內外細胞群開始發育3。受精卵細胞分裂為2、4、8和16細胞，這群少量的細胞被外細胞包圍。通過連續分裂，內外細胞的數量增加，TE上皮化和囊胚腔擴張，形成囊胚結構。

拓撲結構如何與細胞的命運相連系的機制尚不清楚，目前已經提出了幾種模型。例如，細胞的命運可能是細胞位置的結果(圖1-3A);或者預先確定的細胞的命運可以驅使細胞到適當的拓撲學位置(圖1-3B)。隨后的機制預測了在內外細胞群形成之前就可以檢測到前內細胞和前外細胞。然而，盡管人們在這一領域付出了相當多的努力，但目前還沒有找到支持這個預先確定機制的證據。

胚層示蹤法與分子分析法作為兩個主要的研究策略，被運用于尋找關于囊胚期之前的細胞存在預定理論的證據。在胚層示蹤方面，對兩種細胞共存階段的細胞研究發現，兩細胞之間有偏差的發育潛能和TE/ICM的胚層決定是不相關的，這是因為這兩個細胞均參與了TE和ICM的形成4"13。同樣，4細胞階段、8細胞階段的所有細胞也參與了TE和ICM胚層的形成14，15。雖然有報道認為4細胞階段胚層的發育潛能受到了限制7，因而胚外層沒有形成，然而胚層示蹤實驗沒有找到證據證明在內外細胞群形成之前細胞被預先確定為TE或ICM細胞。至于分子分析方面，在16細胞階段之前的細胞亞群中，沒有檢測到可以調控TE/ICM的胚層決定的蛋白質。在4細胞階段的卵裂球中存在一種組蛋白甲基化水平分布不均，這與嵌合體的小鼠的生育能力降低有關16，而其在TE/ICM形成中的功能重要性仍然有待闡明。所以，也沒有分子證據表明在內外細胞群形成之前有前TE細胞或前ICM細胞的存在。相反，當內外細胞群確定了其在胚胎中的位置時，便確立了它未來的發育方向。

如果是細胞位置決定細胞發育方向，那一定存在細胞感應胚胎內位置的機制。長期的研究結果表明細胞在8細胞階段極化17，這個理論認為內/外軸在細胞水平上存在差異。被保守的極性蛋白如非典型蛋白激酶C(aPKC)、Par3和Pa6極化是維持細胞位置所必需的8，細胞接觸則是細胞極化所必需的17。但還沒有分子水平上的證據來確認位置、極化和細胞命運之間的聯系。利用常規的基因敲除技術來研究這個領域是具有挑戰性的。與細胞位置、細胞接觸相關的許多蛋白質是大的基因家族的成員，如aPKC，這表明單基因敲除可能會被遺傳豐余所掩蓋。此外，早期發育階段部分是通過母體提供的蛋白質調控的，因此需要敲除生殖細胞的基因來確定表型。，許多這類蛋白質參與了細胞基本過程如細胞分裂，這使得在發育的過程中研究其功能變得困難。再者，顯性抑制或siRNA的過表達會導致短期或局部功能喪失，這也將阻礙表型的確立。

最終需要一個不同的定位轉錄因子來將內/外差異轉換成基因表達的變化。確定早期胚層發育相關的轉錄因子有以下幾個策略：利用芯片分析著床前的轉錄表達來確定候選的轉錄因子，隨后通過原位雜交篩選囊胚中表達受限的候選因子18;或者通過對囊胚來源的干細胞系進行基因芯片比較來篩選候選因子19。還有就是通過敲除來偶然發現早期致死表型，Cdx2和Tead42e"22便是這樣發現的。

雖然TE的發育需要Cdx2，但是Cdx2可能在TE的形成中沒有起到決定性的作用23，24。研究表明Cdx2mRNA25定位在8細胞階段的細胞外表面，但Cdx2蛋白2426卻沒有。在沒有Cdx2的胚胎中，TE的標記Gata3仍持續表達19，這說明無論是形態學上23，24還是分子水平上，Cdx2都不是TE所必需的，很難相信定位的Cdx2mRNA的表達會在胚層確立中起決定性作用。最近一個與Tead4及輔助因子相關的新的通路被證明在及時胚層決定中發揮了決定性作用。在Cdx2表達的激活中，轉錄共激活子Yap和相關蛋白Taz，表現出對細胞位置敏感的變化27。在囊胚期之前，Yap/Taz定位在外細胞的細胞核和內細胞的細胞質，這一定位是由Hippo信號通路成員Latsl/2的磷酸化來調節的。此外，改變細胞位置會導致Yap定位的相應變化：外細胞嵌入內部，細胞聚集并失去核Yap，而內細胞脫離了周圍的外細胞并獲得核Yap。Tead4是一種DNA結合蛋白，Yap/Taz與Tead4的直接相互作用是Cdx221，22和其他滋養層標記19表達所必需的。雖然Yap/Taz調節信號感知細胞位置的特性或者本質仍然未知，但Hippo信號通路以及與細胞接觸有關的蛋白質如鈣黏蛋白可能參與了這一過程，這無疑將是一個令人興奮的研究領域。

目前已經清楚了Yap/Tead4的上游通路，而對它的下游通路還不清楚。tead4是Cdx2表達所必需的，缺失Tead4的胚胎不能形成囊胚，而Cdx2敲除的胚胎在囊胚形成后死亡。Tead4在ICM中不是必需的21，22，所以一定還有其他的基因與TE中的Cdx2同時作用。目前已經開始研究一些基因，如Gata3X今后尋找參與促進外細胞增殖和構建囊胚的Tead4的靶點將是重要的研究方向。

胚系的維持和干細胞程序：囊胚以外在囊胚中，早期階段的胚系決定轉錄子之間相互作用加強了TE和ICM的命運的建立。在這個階段起中心作用的是Oct4(Pou5fl$和Glr2。Oct4是ICM成熟所必需的SCdx2是TE成熟所必需的23。初步推測這兩個因子之間的相互制約導致了及時胚層的命運決定。在囊胚的TE中，Cdx2抑制O"4和其他ICM的基因的表達23。但在Cdx2缺失的胚胎中，TE仍然可以形成，其他TE的標記也仍然表達19。同樣，在著床后囊胚形成1天后，ICM中的Oct4抑制Cdx2的表達19。因此，在沒有Oct4或Cd.時胚層發育的最初是正常的，但胚胎不能正常表達胚層基因。Cd-2缺失的胚胎盡管表達ICM基因，卻不遵照ICM的命運發育。在Cdx2缺失的胚胎TE中，TE的標記Gata3仍表達19，但此胚胎的凋亡水平比野生型高23。因此可以肯定的是，Cdx2維持了那些將發育成TE的細胞的存活和增殖。與此一致的是，Cdx2在后期的滋養層細胞增殖區持續表達29。O#表達缺失的胚胎不能存活，其原因目前尚未明確。

O#4和Cdx2之間的制約關系在來源于囊胚的干細胞中得到了證實。O"4缺失的胚胎中沒有ES細胞，Cdx2缺失的胚胎沒有TS細胞23，28。已有的ES細胞缺失O"4后會導致Cdx2的上調，并在TS細胞培養基中形成TS-樣細胞3°。同樣，在ES細胞中過表達Cdx2會導致Oc4表達抑制并形成TS-樣細胞2。在ES細胞中其他滋養層細胞因子如Eomes和Gata3也可以誘導滋養層細胞相關的基因表達2，19。這些因子在滋養層細胞成熟過程的晚期發揮作用，卻與定位無關23，31，32。囊胚一旦形成，TE/ICM中的干細胞將啟動某一基因程序維持兩者間的相互制約作用，這使得干細胞的獲得需要跨越囊胚期這一假設顯得合理。而對ICM發育的深入了解則需基于對第二胚層的進一步了解，這將在下一節進行討論。

第二胚層決定：ICM的細分

受精后第3天，囊胚中的ICM包含兩種類型的細胞：外胚層(EPI)和原始內胚層(PE)。只有EPI發育成胚胎，而PE是一個胚層外系，它將發育成于卵黃囊(圖1-1)33"315。PE胚層在剛著床后有兩個重要的角色：其一是為胚胎提供營養；其二，它是一個信號中心，協助原腸胚的前后極性的形成37。TE胚層是一個來源于PE胚層的特殊的干細胞系。多能的干細胞系也被稱為XEN細胞，已確認其來源于PE胚層38(圖1-2)。此外，當過表達PE轉錄因子如Gata4和Gata6時，ES細胞可被誘導成PE狀細胞39。然而Gata4/6在PE發育的后期發揮作用4

異質性和祖細胞分選受精后第4天，囊胚著床。在這個階段，PE是ICM囊胚腔表面的一個獨特的單細胞層。由此，最初的假設認為PE是在囊胚著床時期由直接面向囊胚腔的ICM細胞產生的，并推測在這個階段面向囊胚腔的細胞和深層細胞之間的微環境的差異參與了胚層決定。然而，最近的研究表明，在著床的24小時前可以在囊胚腔檢測到EPI祖細胞和PE祖細胞36，42，43。在這一階段，ICM是一個EPI祖細胞和PE祖細胞的混合細胞群，并表達胚層特異性轉錄因子。在這個階段之前，ICM中的所有細胞均表達Nanog和Gata6;在囊胚擴張過程中，Nanog和Gata6的表達逐漸出現相互排斥，從而以不依賴于位置的方式使兩種祖細胞發生分化36，44。值得注意的是，在ICM中沒有定型的模式決定兩種祖細胞的分布，它們像鹽和胡椒一樣隨機散布在整個ICM。

這些結果表明，著床后兩種隨機分布的胚層祖細胞形成兩個形態不同的胚層。利用活體成像技術對表達熒光胚層標記的轉基因小鼠中的囊泡擴張進行實時觀察支持了這一理論模型。在PdgfraH2B-GFP小鼠的PE中表達了組蛋白H2B-GFP，這表明兩個胚層的分離包