日韩偷拍一区二区,国产香蕉久久精品综合网,亚洲激情五月婷婷,欧美日韩国产不卡

第1章小鼠早期胚胎細(xì)胞的命運(yùn)決定

YojiroYamanaka !AmyRalston

摘要：發(fā)育過程中，最初的胚胎全能干細(xì)胞特異性地形成獨(dú)立的組織胚層。小鼠中形成的及時(shí)胚系是胚外組織。同時(shí)，沒有成為胚外層的細(xì)胞仍保留多能干性，它們可以形成胚胎的所有胚層。多能干細(xì)胞系來源于胚胎的幾個(gè)發(fā)育階段。有趣的是，在同一時(shí)期胚外層已經(jīng)有多能干細(xì)胞系了。因此，檢測早期胚胎細(xì)胞命運(yùn)決定的調(diào)控是研究干細(xì)胞系建立的一個(gè)難得的機(jī)會(huì)。以往的研究為前三個(gè)胚層的形成提出了深刻的見解，而現(xiàn)代分子成像技術(shù)的運(yùn)用進(jìn)一步推動(dòng)了這一領(lǐng)域的發(fā)展。本章我們將介紹目前所發(fā)現(xiàn)的小鼠發(fā)育過程早期三個(gè)胚層建立和維持的多樣的分子機(jī)制。

引言

在小鼠發(fā)育的初期，最初全能細(xì)胞的發(fā)育潛力是受到限制的，僅發(fā)育成小鼠及時(shí)胚層。而在非哺乳動(dòng)物物種中，及時(shí)胚層的建立則可能涉及主體軸的形成，哺乳動(dòng)物的不同在于其首先要完成著床。因此，幾天內(nèi)胚胎和胚外組織之間的差異包括了前兩個(gè)胚層決定(圖1-1)及之前胚層(外胚層、中胚層、內(nèi)胚層)和胚系的建立。這種獨(dú)特的哺乳動(dòng)物發(fā)育模式涉及一種獨(dú)特的細(xì)胞類型，可以從中分離出來并擴(kuò)增為穩(wěn)定的細(xì)胞系。因此，認(rèn)識(shí)胚外組織的起源有助于我們了解干細(xì)胞的形成與分化。以往的研究對(duì)前三個(gè)胚層的形成提出了頗具洞察力的見解，而利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和成像技術(shù)將進(jìn)一步推進(jìn)這一領(lǐng)域的發(fā)展。

受精后第三天，小鼠胚胎(囊胚)包含三個(gè)組織系：外胚層(EPI)、滋養(yǎng)層(TE)和原始內(nèi)胚層(PE)。對(duì)來源于這些胚層的干細(xì)胞系的分離和研究加深了我們對(duì)早期胚胎細(xì)胞命運(yùn)決定的認(rèn)識(shí)。已經(jīng)從囊胚中分離得到三類干細(xì)胞系：胚胎干細(xì)胞、滋養(yǎng)層干細(xì)胞和胚外內(nèi)胚層干細(xì)胞(ES細(xì)胞、TS細(xì)胞和XEN細(xì)胞)。它們均具有干細(xì)胞自我更新及分化為各類成熟細(xì)胞等的特性。同時(shí)，每種干細(xì)胞系仍保有與其來源相關(guān)的特性，包括組織特異性的發(fā)育潛力、形態(tài)、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和生長因子需求\這些干細(xì)胞系的提出不僅為那些需要大量初始原料的研究提供了可擴(kuò)增的純細(xì)胞群，也是了解干細(xì)胞起源的一個(gè)契機(jī)。

從胚胎干細(xì)胞的研究中我們可以對(duì)細(xì)胞命運(yùn)選擇基因進(jìn)行更深入的分子水平分析。

操控某一特定種系調(diào)節(jié)基因可以引起干細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的命運(yùn)改變。例如，一個(gè)滋養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Cdx2就足夠使ES細(xì)胞轉(zhuǎn)變成TS-樣的細(xì)胞2。這類研究表明ES細(xì)胞具有很強(qiáng)的可塑性，以及作為胚層決定因子Cdx2基因的核心作用。胚胎干細(xì)胞也為研究胚層決定基因之間的分子相互作用提供了一個(gè)機(jī)會(huì)，從而成為認(rèn)識(shí)胚胎的細(xì)胞命運(yùn)選擇的模式。然而，在胚層決定基因的研究中發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮作用主要在相對(duì)晚期，因此便提出胚胎早期是如何決定三個(gè)胚層的疑問。

參與及時(shí)胚層形成的機(jī)制可能有很多種，包括細(xì)胞的位置、形狀、極化、信號(hào)和分裂面。在新提出的模式中，早期的前干細(xì)胞程序使組織胚層特異性形成囊胚。而在著床及以后，細(xì)胞命運(yùn)則由干細(xì)胞系中的一個(gè)活化程序所掌控(圖1-2)。

胚層的建立和前干細(xì)胞程序：囊胚的形成

這里我們將討論胚層形成的及時(shí)個(gè)階段：TE和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的形成共同組成囊胚。TE將分化為胎盤，而ICM是胚胎和原始內(nèi)胚層祖細(xì)胞的混合物。在囊胚中，TE圍繞ICM和中空的囊胚腔，胚層示蹤實(shí)驗(yàn)表明TE和ICM細(xì)胞群是從胚胎的內(nèi)外細(xì)胞群開始發(fā)育3。受精卵細(xì)胞分裂為2、4、8和16細(xì)胞，這群少量的細(xì)胞被外細(xì)胞包圍。通過連續(xù)分裂，內(nèi)外細(xì)胞的數(shù)量增加，TE上皮化和囊胚腔擴(kuò)張，形成囊胚結(jié)構(gòu)。

拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如何與細(xì)胞的命運(yùn)相連系的機(jī)制尚不清楚，目前已經(jīng)提出了幾種模型。例如，細(xì)胞的命運(yùn)可能是細(xì)胞位置的結(jié)果(圖1-3A);或者預(yù)先確定的細(xì)胞的命運(yùn)可以驅(qū)使細(xì)胞到適當(dāng)?shù)耐負(fù)鋵W(xué)位置(圖1-3B)。隨后的機(jī)制預(yù)測了在內(nèi)外細(xì)胞群形成之前就可以檢測到前內(nèi)細(xì)胞和前外細(xì)胞。然而，盡管人們在這一領(lǐng)域付出了相當(dāng)多的努力，但目前還沒有找到支持這個(gè)預(yù)先確定機(jī)制的證據(jù)。

胚層示蹤法與分子分析法作為兩個(gè)主要的研究策略，被運(yùn)用于尋找關(guān)于囊胚期之前的細(xì)胞存在預(yù)定理論的證據(jù)。在胚層示蹤方面，對(duì)兩種細(xì)胞共存階段的細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，兩細(xì)胞之間有偏差的發(fā)育潛能和TE/ICM的胚層決定是不相關(guān)的，這是因?yàn)檫@兩個(gè)細(xì)胞均參與了TE和ICM的形成4"13。同樣，4細(xì)胞階段、8細(xì)胞階段的所有細(xì)胞也參與了TE和ICM胚層的形成14，15。雖然有報(bào)道認(rèn)為4細(xì)胞階段胚層的發(fā)育潛能受到了限制7，因而胚外層沒有形成，然而胚層示蹤實(shí)驗(yàn)沒有找到證據(jù)證明在內(nèi)外細(xì)胞群形成之前細(xì)胞被預(yù)先確定為TE或ICM細(xì)胞。至于分子分析方面，在16細(xì)胞階段之前的細(xì)胞亞群中，沒有檢測到可以調(diào)控TE/ICM的胚層決定的蛋白質(zhì)。在4細(xì)胞階段的卵裂球中存在一種組蛋白甲基化水平分布不均，這與嵌合體的小鼠的生育能力降低有關(guān)16，而其在TE/ICM形成中的功能重要性仍然有待闡明。所以，也沒有分子證據(jù)表明在內(nèi)外細(xì)胞群形成之前有前TE細(xì)胞或前ICM細(xì)胞的存在。相反，當(dāng)內(nèi)外細(xì)胞群確定了其在胚胎中的位置時(shí)，便確立了它未來的發(fā)育方向。

如果是細(xì)胞位置決定細(xì)胞發(fā)育方向，那一定存在細(xì)胞感應(yīng)胚胎內(nèi)位置的機(jī)制。長期的研究結(jié)果表明細(xì)胞在8細(xì)胞階段極化17，這個(gè)理論認(rèn)為內(nèi)/外軸在細(xì)胞水平上存在差異。被保守的極性蛋白如非典型蛋白激酶C(aPKC)、Par3和Pa6極化是維持細(xì)胞位置所必需的8，細(xì)胞接觸則是細(xì)胞極化所必需的17。但還沒有分子水平上的證據(jù)來確認(rèn)位置、極化和細(xì)胞命運(yùn)之間的聯(lián)系。利用常規(guī)的基因敲除技術(shù)來研究這個(gè)領(lǐng)域是具有挑戰(zhàn)性的。與細(xì)胞位置、細(xì)胞接觸相關(guān)的許多蛋白質(zhì)是大的基因家族的成員，如aPKC，這表明單基因敲除可能會(huì)被遺傳豐余所掩蓋。此外，早期發(fā)育階段部分是通過母體提供的蛋白質(zhì)調(diào)控的，因此需要敲除生殖細(xì)胞的基因來確定表型。，許多這類蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞基本過程如細(xì)胞分裂，這使得在發(fā)育的過程中研究其功能變得困難。再者，顯性抑制或siRNA的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致短期或局部功能喪失，這也將阻礙表型的確立。

最終需要一個(gè)不同的定位轉(zhuǎn)錄因子來將內(nèi)/外差異轉(zhuǎn)換成基因表達(dá)的變化。確定早期胚層發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有以下幾個(gè)策略：利用芯片分析著床前的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來確定候選的轉(zhuǎn)錄因子，隨后通過原位雜交篩選囊胚中表達(dá)受限的候選因子18;或者通過對(duì)囊胚來源的干細(xì)胞系進(jìn)行基因芯片比較來篩選候選因子19。還有就是通過敲除來偶然發(fā)現(xiàn)早期致死表型，Cdx2和Tead42e"22便是這樣發(fā)現(xiàn)的。

雖然TE的發(fā)育需要Cdx2，但是Cdx2可能在TE的形成中沒有起到?jīng)Q定性的作用23，24。研究表明Cdx2mRNA25定位在8細(xì)胞階段的細(xì)胞外表面，但Cdx2蛋白2426卻沒有。在沒有Cdx2的胚胎中，TE的標(biāo)記Gata3仍持續(xù)表達(dá)19，這說明無論是形態(tài)學(xué)上23，24還是分子水平上，Cdx2都不是TE所必需的，很難相信定位的Cdx2mRNA的表達(dá)會(huì)在胚層確立中起決定性作用。最近一個(gè)與Tead4及輔助因子相關(guān)的新的通路被證明在及時(shí)胚層決定中發(fā)揮了決定性作用。在Cdx2表達(dá)的激活中，轉(zhuǎn)錄共激活子Yap和相關(guān)蛋白Taz，表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞位置敏感的變化27。在囊胚期之前，Yap/Taz定位在外細(xì)胞的細(xì)胞核和內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，這一定位是由Hippo信號(hào)通路成員Latsl/2的磷酸化來調(diào)節(jié)的。此外，改變細(xì)胞位置會(huì)導(dǎo)致Yap定位的相應(yīng)變化：外細(xì)胞嵌入內(nèi)部，細(xì)胞聚集并失去核Yap，而內(nèi)細(xì)胞脫離了周圍的外細(xì)胞并獲得核Yap。Tead4是一種DNA結(jié)合蛋白，Yap/Taz與Tead4的直接相互作用是Cdx221，22和其他滋養(yǎng)層標(biāo)記19表達(dá)所必需的。雖然Yap/Taz調(diào)節(jié)信號(hào)感知細(xì)胞位置的特性或者本質(zhì)仍然未知，但Hippo信號(hào)通路以及與細(xì)胞接觸有關(guān)的蛋白質(zhì)如鈣黏蛋白可能參與了這一過程，這無疑將是一個(gè)令人興奮的研究領(lǐng)域。

目前已經(jīng)清楚了Yap/Tead4的上游通路，而對(duì)它的下游通路還不清楚。tead4是Cdx2表達(dá)所必需的，缺失Tead4的胚胎不能形成囊胚，而Cdx2敲除的胚胎在囊胚形成后死亡。Tead4在ICM中不是必需的21，22，所以一定還有其他的基因與TE中的Cdx2同時(shí)作用。目前已經(jīng)開始研究一些基因，如Gata3X今后尋找參與促進(jìn)外細(xì)胞增殖和構(gòu)建囊胚的Tead4的靶點(diǎn)將是重要的研究方向。

胚系的維持和干細(xì)胞程序：囊胚以外在囊胚中，早期階段的胚系決定轉(zhuǎn)錄子之間相互作用加強(qiáng)了TE和ICM的命運(yùn)的建立。在這個(gè)階段起中心作用的是Oct4(Pou5fl$和Glr2。Oct4是ICM成熟所必需的SCdx2是TE成熟所必需的23。初步推測這兩個(gè)因子之間的相互制約導(dǎo)致了及時(shí)胚層的命運(yùn)決定。在囊胚的TE中，Cdx2抑制O"4和其他ICM的基因的表達(dá)23。但在Cdx2缺失的胚胎中，TE仍然可以形成，其他TE的標(biāo)記也仍然表達(dá)19。同樣，在著床后囊胚形成1天后，ICM中的Oct4抑制Cdx2的表達(dá)19。因此，在沒有Oct4或Cd.時(shí)胚層發(fā)育的最初是正常的，但胚胎不能正常表達(dá)胚層基因。Cd-2缺失的胚胎盡管表達(dá)ICM基因，卻不遵照ICM的命運(yùn)發(fā)育。在Cdx2缺失的胚胎TE中，TE的標(biāo)記Gata3仍表達(dá)19，但此胚胎的凋亡水平比野生型高23。因此可以肯定的是，Cdx2維持了那些將發(fā)育成TE的細(xì)胞的存活和增殖。與此一致的是，Cdx2在后期的滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖區(qū)持續(xù)表達(dá)29。O#表達(dá)缺失的胚胎不能存活，其原因目前尚未明確。

O#4和Cdx2之間的制約關(guān)系在來源于囊胚的干細(xì)胞中得到了證實(shí)。O"4缺失的胚胎中沒有ES細(xì)胞，Cdx2缺失的胚胎沒有TS細(xì)胞23，28。已有的ES細(xì)胞缺失O"4后會(huì)導(dǎo)致Cdx2的上調(diào)，并在TS細(xì)胞培養(yǎng)基中形成TS-樣細(xì)胞3°。同樣，在ES細(xì)胞中過表達(dá)Cdx2會(huì)導(dǎo)致Oc4表達(dá)抑制并形成TS-樣細(xì)胞2。在ES細(xì)胞中其他滋養(yǎng)層細(xì)胞因子如Eomes和Gata3也可以誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)的基因表達(dá)2，19。這些因子在滋養(yǎng)層細(xì)胞成熟過程的晚期發(fā)揮作用，卻與定位無關(guān)23，31，32。囊胚一旦形成，TE/ICM中的干細(xì)胞將啟動(dòng)某一基因程序維持兩者間的相互制約作用，這使得干細(xì)胞的獲得需要跨越囊胚期這一假設(shè)顯得合理。而對(duì)ICM發(fā)育的深入了解則需基于對(duì)第二胚層的進(jìn)一步了解，這將在下一節(jié)進(jìn)行討論。

第二胚層決定：ICM的細(xì)分

受精后第3天，囊胚中的ICM包含兩種類型的細(xì)胞：外胚層(EPI)和原始內(nèi)胚層(PE)。只有EPI發(fā)育成胚胎，而PE是一個(gè)胚層外系，它將發(fā)育成于卵黃囊(圖1-1)33"315。PE胚層在剛著床后有兩個(gè)重要的角色：其一是為胚胎提供營養(yǎng)；其二，它是一個(gè)信號(hào)中心，協(xié)助原腸胚的前后極性的形成37。TE胚層是一個(gè)來源于PE胚層的特殊的干細(xì)胞系。多能的干細(xì)胞系也被稱為XEN細(xì)胞，已確認(rèn)其來源于PE胚層38(圖1-2)。此外，當(dāng)過表達(dá)PE轉(zhuǎn)錄因子如Gata4和Gata6時(shí)，ES細(xì)胞可被誘導(dǎo)成PE狀細(xì)胞39。然而Gata4/6在PE發(fā)育的后期發(fā)揮作用4

異質(zhì)性和祖細(xì)胞分選受精后第4天，囊胚著床。在這個(gè)階段，PE是ICM囊胚腔表面的一個(gè)獨(dú)特的單細(xì)胞層。由此，最初的假設(shè)認(rèn)為PE是在囊胚著床時(shí)期由直接面向囊胚腔的ICM細(xì)胞產(chǎn)生的，并推測在這個(gè)階段面向囊胚腔的細(xì)胞和深層細(xì)胞之間的微環(huán)境的差異參與了胚層決定。然而，最近的研究表明，在著床的24小時(shí)前可以在囊胚腔檢測到EPI祖細(xì)胞和PE祖細(xì)胞36，42，43。在這一階段，ICM是一個(gè)EPI祖細(xì)胞和PE祖細(xì)胞的混合細(xì)胞群，并表達(dá)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子。在這個(gè)階段之前，ICM中的所有細(xì)胞均表達(dá)Nanog和Gata6;在囊胚擴(kuò)張過程中，Nanog和Gata6的表達(dá)逐漸出現(xiàn)相互排斥，從而以不依賴于位置的方式使兩種祖細(xì)胞發(fā)生分化36，44。值得注意的是，在ICM中沒有定型的模式?jīng)Q定兩種祖細(xì)胞的分布，它們像鹽和胡椒一樣隨機(jī)散布在整個(gè)ICM。

這些結(jié)果表明，著床后兩種隨機(jī)分布的胚層祖細(xì)胞形成兩個(gè)形態(tài)不同的胚層。利用活體成像技術(shù)對(duì)表達(dá)熒光胚層標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠中的囊泡擴(kuò)張進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察支持了這一理論模型。在PdgfraH2B-GFP小鼠的PE中表達(dá)了組蛋白H2B-GFP，這表明兩個(gè)胚層的分離包