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章 緒論

節 工業微生物育種在生物發酵產業中的地位

工業微生物菌種選育在生物發酵產業中占有重要地位，是決定該發酵產品能否具有工業化價值及發酵過程成敗與否的關鍵。現酵工業之所以如此迅猛發展，除了發酵工藝改進和發酵設備更新之外，更重要的是由于進行了菌種的選育及其改良，為發酵工藝提供了人類需要的各種類型的突變菌株，從而使抗生素、酶制劑、氨基酸、有機酸、維生素、核苷酸、激素、色素、生物堿、不飽和脂肪酸以及其他生物活性物質等產品的產量成倍，甚至成千倍地增長，同時產品的質量也不斷提高。因此，工業微生物育種對于提高生物發酵產業產品的產量和質量，進一步開發利用微生物資源，增加生物發酵產業產品的品種具有重大意義。

用于工業生產的微生物菌種要具有以下特性。

1) 在遺傳上必須是穩定的。

2) 易于產生許多營養細胞、孢子或其他繁殖體。

3) 必須是純種，不應帶其他雜菌及噬菌體。

4) 種子的生長必須旺盛、迅速。

5) 產生所需要的產物時間短。

6) 比較容易分離提純。

7) 有自身保護機制，抵抗雜菌污染能力強。

8) 能保持較長的良好經濟性能。

9) 菌株對誘變劑處理較敏感，從而可能選育出高產菌株。

10) 在規定的時間內，菌株必須產生預期數量的目的產物，并保持相對地穩定。

具備以上條件的菌株，才能保障發酵產品的產量和質量，這是發酵工業的目的和要求。野生型菌株是不可能具備上述條件的，必須通過對野生型菌株的選育才能實現。發酵工業為人們提供了各種各樣的發酵產品，而工業微生物育種為發酵工業的上述貢獻奠定了必不可少的基礎。

第二節 工業微生物育種的進展

工業微生物育種，無論從自然變異中選擇或是人工誘變的選擇，都是建立在遺傳和變異的基礎上。遺傳和變異是生物界生命活動的基本屬性之一。沒有變異，生物界就失去進化的素材；而沒有遺傳，變異也無法積累。同樣，就優良菌株的選育來講，沒有變異就沒有選擇的素材；沒有遺傳，選到的優良性狀也不能進行培育。由此可見，工業微生物育種學是建立在微生物遺傳學基礎上，而兩者是相輔相成的。

微生物本身，在漫長的進化過程中，逐漸達到適合于它的生存和繁衍的水平。野生型微生物經自然選擇，能適應它的周圍環境，能適應同其他物種的競爭，但卻不能按照人的意志生產人們需要的物質。因此，從人類的利益出發，必須對工業微生物菌種進行改良，使之產生數量遠遠超出微生物本身需要的物質，或者不是它正常產生的新物質。

對工業微生物菌種進行有目的的改良，是在有關微生物遺傳學知識被人們了解并掌握之后才成為可能的。同時，這種改良涉及多學科領域。

1927年，人們發現了X射線誘發突變。1945年后，各種具有誘變能力的輻射和化學誘變劑的發現，為這種改良提供了非常有用的工具。通過誘變和篩選的"選擇"，不僅在提高現有產品的發酵單位上發揮了巨大作用，而且在當前多種新發酵產品的改進方面也具有很大潛力。通過對誘變作用和DNA修復機制的深入了解，可以設計出所希望的突變型的方案。對基因表達和代謝途徑調控機制的進一步闡明，可以設計出使所需要的突變特性得以充分表達的篩選條件。自動儀表裝置和微機的應用，則可使單位時間內獲得分離的菌株數量大大增加。這些技術的綜合應用，使獲得優良菌株的概率大為提高。

工業微生物育種技術的發展大致經歷如下階段。

隨著微生物學的發展，特別是發明微生物純種培養法之后，開始了微生物純種的自然選育，對工業微生物育種有很大的影響。當時，在酒精發酵中，推廣了自然選育的純系良種，扭轉了酒精生產不穩定的現象。這是早應用微生物遺傳學原理于微生物育種實踐而提高發酵產物水平的一個成功實例。自然選育方法雖已沿用多年，迄今仍是工業微生物育種的手段之一。

由于自然突變頻率低，單純依賴自然界存在的微生物群體來進行的自然選育無疑有很大局限性。繼而進行了人工誘變選育，取得了很大效果。

20世紀40年代初，Beadle和Tatum采用X射線和紫外線等輻射因子來誘變紅色面包霉等，獲得了各種代謝障礙的變株，并于1941年提出"一個基因一種酶"的學說，闡述基因與酶功能的直接關系，使遺傳學從細胞水平發展到分子水平，促進了工業微生物育種技術的發展。

誘變育種是以人工誘變基因突變為基礎的，過去是工業微生物育種的主要方法，至今仍是世界各國行之有效的重要方法，尤其發酵工業中的各種優良高產菌株絕大部分都是以誘變育種方法獲得的。例如，抗生素生產中的青霉素產生菌特異青霉(Penicillium notatum)是1929年英國的Flemirlg發現的。當時表層培養只有1~2U/ml，而1943年美國北部地區研究所實驗室分離出產黃青霉(Pen.chrysogenum)NRRL9551同時伴以沉沒培養成功，則達到20U/ml，在此基礎上，經過40多年的誘變育種，到目前已達80000U/ml以上，比原始菌株的產量提高了上千倍。至于其他抗生素品種，如鏈霉素、土霉素、四環素、紅霉素及灰黃霉素等，都由原來的幾十單位提高到目前的幾萬單位。

除抗生素外，其他許多重要發酵產品也都由于進行了有效的菌種選育工作，在產量和質量上都取得明顯的提高，其主要手段也都是誘變育種。

但是，某一菌株長期使用誘變劑處理之后，除產生誘變劑"疲勞效應"外，還會引起菌種生長周期的延長、孢子量減少、代謝減慢等，這對發酵工藝的控制是不利的。而雜交育種可以作為育種的另一手段，其成功不僅表現在種內雜交上，而且在種間雜交以至屬間雜交都取得令人滿意的結果。

雜交育種的主要目的是把不同菌株的優良經濟性狀集中于重組體中，克服長期用誘變劑處理造成的上述缺陷，同時雜交還是增加產品新品種的手段之一。當然，雜交育種也應當建立在誘變育種的基礎上，沒有誘變育種，雜交菌株的產量是難以繼續提高的。

代謝控制育種以20世紀50年代末谷氨酸發酵取得成功使發酵工業進入第三轉折期——代謝控制發酵時期，并在其后的年代里得到飛躍的發展。

代謝控制育種活力在于以誘變育種為基礎，獲得各種解除或繞過了微生物正常代謝途徑的突變株，從而人為地使有用產物選擇性地大量生成和累積。代謝控制育種的崛起標志著誘變育種發展到理性階段，導致了氨基酸、核苷酸及某些次級代謝產物的高產菌株大批地投入生產。

隨著基因工程在工業微生物菌種選育中的應用，世界上以基因工程方法創造的各種工程菌不計其數，實現了人為的菌種選育，一切可以按照人們事先設計和控制的方法進行育種，這是一種的育種技術。

基因工程菌的構建和應用，已在多方面顯示出其巨大的生命力。通過基因工程的方法生產藥物——已獲得包括治療用藥物、疫苗、單克隆抗體及診斷試劑等多種獲得上市的品種；通過基因工程方法提高菌株生產能力——已獲得包括氨基酸類、工業用酶制劑及頭孢霉素C在內的工程菌；通過基因工程方法改造傳統發酵工藝——如氧傳遞有關的血紅蛋白基因克隆到遠青鏈霉菌，降低了對氧的敏感性；通過基因工程方法提高菌種抗性等。以上諸多類型的基因工程菌構建，使工業微生物育種突破了傳統的、經典的育種模式，在工業微生物育種中展示了極為光明的前景。

基因組改組(genome shuffing)是一種細胞定向進化技術。2002年Zhang等在Nature上首次發表了微生物基因組改組育種報道。基因組改組是多親本微生物之間發生重組，先用誘發突變或點突變技術產生復雜子代組合庫，再利用改組技術將有利性狀組合拼接，快速進化目標菌的一種選育微生物的新方法。

基因組改組技術巧妙地模擬和發展了自然進化過程，以分子進化為核心，用工程學原理加以人工設計，在實驗室實現微生物全細胞快速定向進化，僅需1~2年就可完成自然界數百萬年才能達到的進化目標，使得人們能夠在較短的時間內獲得性狀大幅度改良的正向突變的目標菌株，成為微生物育種的前沿技術。

分子定向進化(directed molecular evolution)是一種DNA水平的分子定向進化技術。20世紀90年代中期美國Arnold和Stemmer首先報道了蛋白質(酶)分子改造成功的例子，從此拉開了酶蛋白分子定向進化育種的序幕。分子定向進化屬于蛋白質(酶)非理性設計的主要范疇，它不需要了解蛋白質的空間結構和催化機制，在實驗室中人為創造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外進行酶蛋白基因的改造，并定向篩選出所需特性的突變蛋白。這樣就能在較短時間內完成漫長的自然進化過程，甚至可以在幾個月或幾周的時間內創造出優化的酶蛋白，而在自然的進化過程中，要得到這個結果需要幾千萬年之久。

高通量篩選(high-throughput screening)是微生物育種技術的重要組成部分，在工業微生物育種過程中，無論是傳統的誘變育種、雜交育種、基因組改組育種、現代基因工程育種及分子定向進化育種等，建庫后，都要對文庫進行篩選。而文庫的庫容量很大，各個樣品的質量參差不齊，具有很大的性。使用傳統零敲碎打的篩選方法，篩選量低，概率小，工作量大，要耗費大量的人力、物力。在這種背景下，高通量篩選技術孕育而生。

高通量篩選技術的核心，首先必須根據目的樣品的特性，開發出合適的篩選模型，將樣品的這些特性轉化成可以用攝像頭和計算機傳感器識別的光信號或者電信號。此外，要有自動化或者自動化的實驗操作系統，能夠進行移液、接種、清洗等設備操作。而且必須具備以下特點：具有在高潔凈度下工作的能力，不引起污染，可多通道一次性進行多組操作，操作速度快，具有良好的軟件和硬件兼容性，能與監測設備對接，實驗數據可以在多種軟件平臺上進行分析，能使用各種通用型規格的耗材。

隨著工業微生物育種技術的不斷創新，尤其分子育種的手段與方法有了嶄新的進展，極大地豐富了工業微生物育種的內容。

在工業微生物生產菌種基因的表達系統方面，除了早采用的原核表達系統和隨后采用的酵母表達系統外，還實現了絲狀真菌表達系統和哺乳動物細胞表達系統，為工業微生物工程菌的構建創造了創新性的技術基礎。

為提高工業微生物生產菌株的產量，重組載體誘變方法已得以實現，其中質粒直接誘變可通過化學誘變劑與質粒反應時間的長短來控制突變率，篩選目的突變菌株已有成功實例。

基因敲除是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的一種分子生物學方法，它具有定位性強、插入基因隨染色體DNA穩定遺傳、操作方便等優點。它為定向改造工業微生物品種提供了重要的技術支撐。筆者在闡明芳香族氨基酸代謝途徑的基礎上，通過敲除L-色氨酸菌株的tyrA基因獲得了酪氨酸營養缺陷型菌株，應用這種營養缺陷型，可使代謝支路的中間體預苯酸不流向酪氨酸生成的方向，使色氨酸的合成有充足的原料。發酵試驗結果顯示：工程菌的發酵液中沒有酪氨酸的存在，同時L-色氨酸的產量較原始菌株提高近1倍，同樣，該技術也在L-苯丙氨酸的工程菌構建中取得成功。

全局轉錄機器工程育種是一種通過引入全局轉錄擾動來獲得多尺度細胞表型突變庫的新方法，可以快速、高效地獲得性能顯著提升的細胞表型重要新技術。

工業微生物高密度培養，又稱高細胞密度發酵技術，是在傳統發酵技術上改進的發酵技術，利用一定的培養技術和裝置，極大地改進了發酵工藝，使菌體密度較普通培養有顯著提高，增加工程菌對數期的生長時間、相對縮短衰亡時間來提高菌體的發酵密度，終提高產物的比生產率，不僅可減少培養體積，強化下游分離提取，還可以縮短生產周期，減少設備投資從而降低生產成本，極大地提高市場競爭力。

工業微生物工程菌構建成功之后，關鍵還在于如何在特定的裝備條件下，使其目的產物高效表達化，其中工業微生物工程菌的培養基優化是使該工程菌株高產性狀及其他優良特性高效表達的重要發酵技術，除傳統的正交試驗優化方法外，均勻實驗設計優化方法、響