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內容簡介

毒性病理學作為一門新興的學科，是病理學在毒理學研究中的應用，是采用形態學的觀察方法研究藥品、食品、化學品等對實驗動物的組織和細胞造成病理性改變的損傷部位、損害性質及程度、發生過程和轉化規律，并以此為依據推斷其對人類的靶器官、毒性作用劑量以及提供使用參考依據等，可以說毒性病理學的數據或結論往往決定藥品、食品、化學品、農藥等研發項目的進展。

國家“重大新藥創制”重大科技專項中將藥物安全性評價平臺建設列為重要的支持平臺之一，提出的重要任務是要進一步完善和加強GLP管理體系建設，特別強調要完善GLP規范的藥物安全性評價中毒性病理評價系統，著重提高毒性病理診斷水平，規范毒性病理學診斷術語，開展病理新技術新方法研究，獲得國際同行認可，使我國的新藥GLP非臨床研究逐步與國際接軌。由此可見，毒性病理學在藥物的安全性評價中有極其重要的地位和作用。

毒性病理學的技術和方法不僅應用于藥物安全性評價，而且，廣泛應用于食品(保健食品)，醫療器械，農藥等的安全性評價，食品(保健食品)的功能評價檢驗，以及所有利用各種實驗動物的科學研究中。為保障上述研究、檢驗和評價的科學、可行、客觀、公正性，建立系統的規范的毒性病理學研究和評價體系，病理學技術和方法是關鍵。

由于我國安全性評價及毒性病理學起步較晚，雖然有多部理論性較強的書籍，但是急需一部針對病理學具體操作技術和方法學的系統的總結，以及流程細節、實驗技巧、常見問題及對策的專著。

本書包括藥物臨床前安全性評價、食品(保健食品)毒理學試驗、醫療器械安全性評價、農藥毒理學試驗等的動物解剖、取材、制片、染色等全過程的病理學方法與技術。每一個細節都以圖文并茂的形式展現規范化的操作及注意事項，并總結了常見問題，分析原因，提出解決方法等，希望即便是初學者也能按圖索驥。尤其是填補國內缺乏藥物局部刺激性試驗規范的空白，糾正現行保健食品功能評價規范中一些違背病理學原則，不易操作等問題，特別是推出醫療器械檢驗中植入試驗的病理學方法與技術，解決了業內好的經驗很難共享，各個機構不得不各自摸索的不利發展狀況。本書組織了藥物安全性評價GLP實驗室，藥檢系統，醫療器械檢測中心，疾病預防控制系統，高校及第三方醫學檢驗機構等十余家機構的毒性病理負責人擔任本書的參編人員，確保本書是一部出自具備多年豐富的一線工作經驗的行家里手的實用、科學、有效、可行的精品。希望本書能為諸多各行各業涉及動物實驗的人員的拐杖，順利開展科研以及檢驗工作。

編輯推薦

毒性病理操作技術是病理診斷的基礎和質量保障，而規范系統的操作技術是保障質量的關鍵，本書對指導和規范病理技術人員的工作有重要指導作用，也是新形勢下不同領域毒性病理從業人員發揚“工匠”精神緊密合作的成果，相信隨著該書的出版發行，必將推進我國毒性病理操作技術的規范化進程，將對提高我國毒性病理診斷和發展發揮很好的作用。

作者簡介

金毅，女，1971年12月生。醫學病理學博士(日本國立名古屋大學)，理學碩士(沈陽藥科大學)，主任藥師。中國藥學會首屆毒性病理專業委員會委員，中國毒理學會首屆毒性病理專業委員會委員，中國南部地區毒性病理學組主任委員兼秘書長，中國獸醫病理學家。廣東省科技咨詢專家、深圳市科技創新委專家、深圳市科協組織的專家人才聯合會主要發起專家兼理事、清華大學工程碩士聯合導師、深圳市南山區科技專家、第二屆深圳市預防接種異常反應調查診斷組專家、2013年-2016年中國毒性病理檢測室間比對活動技術專家、2015年-2017年主持部級醫學繼續教育項目“毒性病理培訓班”(項目編號：2016-01-04-062)。《中國實驗動物學報》和《中國比較醫學雜志》特約審稿人、2014年度審稿人、《中國食品衛生雜志》審稿人。

1997年哈爾濱醫科大學畢業留校任教，獲得中青年教師講課大賽和教學實踐獎；1999年公派日本留學工作十余年，參與多項日本國部級重點科研COE項目，推動并主要參與日本國際合作課題項目與中國的合作。曾任日本病理學會、日本腫瘤學、日本神經化學學會會員；2011年作為海外人才引進深圳市藥品檢驗研究院(深圳市醫療器械檢測中心)，從事食品藥品安全性評價工作，發揮毒性病理學，毒理學，藥理學等專業優勢，主持和參與多項科研課題，培養和帶教學生及專業人員。

回國后，獲得2015年度廣東省科技進步二等獎(第三完成人)；2016年度深圳市科技進步二等獎(及時完成人)； 2016年度《中國新藥雜志》論文獎(獨立作者)； 2016年度深圳市藥學會論文一等獎(獨立作者)； 2014年度，2015年度《中國實驗動物學報》和《中國比較醫學雜志》審稿人；2013年上海研究生暑期學校《新藥評價前沿培訓班》一等獎。

共發表SCI論文4篇和其他論文50余篇，軟件著作權2件，新型實用專利1件。

深圳市藥品檢驗研究院成立于1982年(2003年加掛“深圳市醫療器械檢測中心”牌子)，是依法執行國家對藥品、保健食品、化妝品、醫療器械技術監督檢驗的法定性專業檢驗機構和科研機構。是國家授權的化妝品行政許可檢驗機構、港澳地區中成藥注冊檢驗機構、醫療器械監督檢驗注冊檢驗機構、保健食品注冊檢驗復核檢驗機構、廣東省保健食品化妝品監督檢驗機構、廣東省國產非特殊用途化妝品備案檢驗機構，是國家博士后科研工作站設站單位、廣東省和深圳市博士后創新實踐基地。

宋向榮，女，1978年4月生。醫學博士、副主任醫師。廣東省職業病防治院毒理實驗所副所長，中國毒理學會中國毒理學會毒性病理學專業委員會委員及副秘書長，中國藥學會毒性病理專業委員會委員，中國藥學會毒性病理專業委員會南部地區學組副主任委員，中華預防醫學會勞動衛生與職業病分會職業與環境病理學組委員，《中國職業醫學》審稿專家。2013年-2016年四屆毒性病理檢測室間比對活動的發起人和主要組織者，2014年主持國內首個毒性病理部級繼續醫學教育項目“毒性病理診斷與技術應用研討班”(2014-12-04-007 (國))，2015年研發毒性病理檢測管理軟件并注冊軟件著作權，近年來主持1項國家自然基金青年基金項目(81202246)，主持和參加十幾項省級、廳級科研課題，20余篇。

廣東省職業病防治院創建于1960年，是廣東省衛生計生委直屬的正處級公益一類公共衛生機構、廣東省中毒與職業病防治的業務技術指導中心、國家化學中毒和核輻射醫療救治基地、國家臨床重點專科(職業病科)、國家和應急醫學救援分隊，建有全國及時個省級職業病防治重點實驗室。近年來，妥善應對和處理福島核泄露事故、北江鉈污染、鎘污染，紫金、仁北兒童鉛中毒及深圳塵肺門事件等職業病和中毒事件百余起，在廣東省突發公共衛生事件處置過程中發揮技術支撐作用；已經建成產、學、研項融合的職業危害預防控制體系，在有機溶劑中毒等職業病發病機制、診斷、治療和控制方面取得顯著成效，在廣東省內新發現26種職業病。

付新錄，男，1976年7月生。醫學碩士，高級工程師。中山大學實驗動物中心、中山大學藥學院藥物安全性評價中心(GLP 實驗室)病理負責人。中國藥學會毒性病理專業委員會委員，廣東省毒理學會理事，廣東省藥理學會藥物毒理專業委員會委員，廣東省食品藥品審評認證技術協會會員，中國毒理學會毒性病理專業委員會委員，中國獸醫病理學會會員，廣東省科技廳項目評審專家，主持或參加省市級科技計劃項目8項，20篇。

楊照新，男， 1973年4月生。醫學碩士，副研究員，海南省藥物安全性評價研究中心(GLP實驗室)臨床病理研究部門負責人。主要從事藥物安全性評價毒性病理研究工作，包括實驗動物剖檢取材、病理標本制作、閱片和撰寫毒性病理診斷報告等，涉及局部毒性、單次給藥毒性、多次給藥毒性及免疫毒性病理檢查。中國藥學會毒性病理專業委員會委員，中國免疫學會會員。

2012年做為及時發明人身份共獲得兩項實用新型專利，專利號分別為“ZL 2012 2 02024842.5”和“ZL 2012 2 0204843.X”。

2014年獲得海南省科學獎二等獎。

翁銀標，男，1979年3月生。2006年7月畢業于云南農業大學預防獸醫專業，獸醫病理方向。同年7月進入廣州醫藥工業研究院工作(國家廣州新藥安全評價研究重點實驗室，GLP實驗室)，主要從事藥物毒性病理工作，以主要科研人員參加2006年度廣州市海珠區重點科技計劃項目-新藥安全性評價研究關鍵技術-毒性病理學評價標準化研究；參與130多項藥物的毒性病理評價工作。2009年11月起進入全國十大醫療器械檢測中心國家食品藥品監督管理局廣州醫療器械質量監督檢驗中心從事醫療器械、藥品包裝材料和醫用有機硅生物材料等產品的生物性能檢測工作；參加了藥品包裝材料標準生物性能部分的勘誤工作，起草了聚丙烯輸液瓶的非標生物性能檢測方案，參與GB/T 16886.16 征求意見稿的修改工作，并主持了廣東省醫療器械質量監督所科研項目《無針注射滲透深度的相關研究》。現從事醫療器械監管工作。

碩士論文《內毒素對肝臟Bcl-2、Fas基因表達的影響及陽離子A保護效應研究》獲云南省碩士學位論文，先后以及時作者4篇(核心期刊1篇)，合作6篇。

王鳳巖，女，1971年9月生。醫學碩士，主任技師。2001年畢業于暨南大學醫學院組織學與胚胎學專業，于廣東省疾病預防控制中心衛生毒理所工作，主要負責健康相關產品的毒理學安全性評價與毒理病理組織學檢查、保健食品功能學檢驗與評價，參與廣東省重大食品安全事件的衛生毒理學檢驗。2010年參與國家863計劃項目“功能性食品安全性評價與功能因子關鍵檢驗技術”中廣東涼茶慢性毒性的研究，同年參與設計了“低氧分壓動物呼吸效應實驗裝置”，模擬常壓缺氧環境，該項裝置已申請國家專利；2013年參與編寫了《食品安全評估：毒理學安全評價方法應用》。2010年通過了中國毒理學會資格認證委員會的毒理學綜合考試，獲得了中國毒理學家資格。2014年任廣東省毒理學會及時屆理事會理事。2015年任南部地區毒性病理專業委員會副主任委員。

廣東省疾病預防控制中心先后通過了亞太實驗室認可合作組織(APLAC)同行評審、中國計量認證國家認可委員會(CNCA)、中國合格評定國家認可委員會(CNAS)。2013年中心參與了食品安全國家標準中部分毒理學評價方法的修訂。

本書聘請了3位顧問，以期從全局性、前瞻性和技術性等方面給予指導和把關。包括我國“藥物安全性評價及時人”袁伯俊將軍級教授(第二軍醫大學藥物安全性評價中心)，藥審中心專家；魯藝院長(深圳市藥品檢驗研究院(深圳市醫療器械檢測中心))；徐峰教授(沈陽藥科大學)。

本書還特別聘請中國實驗動物學會理事長秦川教授，博士導師(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所)作為本書的主審。

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第二章藥物常用局部刺激性試驗方法與技術

第二節肌肉刺激性試驗

一、肌肉刺激性試驗方法

1. 實驗動物：體重在2.5~3.5kg 的白色家兔

由于家兔的股四頭肌的大小較適合肌肉注射并易于觀察，目前，在國際上被廣泛應用于肌肉刺激性試驗。其次選用250~300g體重的大鼠。

實驗動物的性別雌雄不拘，每個實驗組的動物數量不少于3只。

2. 受試物：原則上與臨床劑量相同，較大給藥體積不超過1ml

注射劑量的設置，一般與臨床使用劑量相同，也可根據臨床用藥方案和動物情況等，調整給藥容積及速率。建議較大藥物容量不超過1ml。

3. 注射要點

(1)注射部位：股四頭肌的股直肌。

在大腿前側，膝關節和股骨關節之間的1/2處垂直進針。

(2)在實驗動物一側股四頭肌注射藥物，另一側注射生理鹽水作為陰性對照。

設置陰性對照組，通過比較陰性對照組與實驗組，有利于確認給藥組的病變是否為藥

物因素引發。

(3)注射器：1ml的一次性注射器(即4號針頭)。

(4)注射要點：①注射前，剃掉注射部位的兔毛，用酒精棉球消毒；②針頭垂直刺入

1cm，并固定好；③緩慢注射，1ml/10s；④注射結束后，迅速拔針，不按摩注射部位。

采用無菌操作，注射前用酒精棉球消毒。為了避免注射以外的刺激因素，不對注射部位進行臨床上使用的注射部位的按摩。

4. 觀察內容

(1)注射時觀察：動物是否有躁動等反應，以及注射局部有無改變。

(2)給藥后48h觀察：注射部位有無改變。

5. 檢查方法

(1)麻醉后放血處死。

(2)解剖取出股四頭肌：在實驗動物的大腿前側，從膝關節至腹股溝切開皮膚，將股四頭肌的筋膜切開后，用鈍器分離股四頭肌，并取出。

(3)觀察股四頭肌：在肌肉表面病變最顯著處，沿肌束走形縱行切開，觀察縱斷面的改變，并用福爾馬林固定，以供組織病理學檢查。

由于股四頭肌是一塊相對寬而扁平的肌肉塊，且肌肉顏色較白，如果存在肌肉刺激性變化，首先能在肌肉靠近皮膚側觀察到，因此，建議首先記錄肌肉表面看到的改變及其長徑和短徑。然后，沿肌肉走行在病變最顯著處縱向切開觀察縱切面，記錄病變顏色及其長徑和短徑；如果沒有顯著病變，則在進針部位縱切，觀察。

(4)取材：在縱切口左側沿肌肉走行，取縱斷面；右側垂直于肌肉走行，取橫斷面。

由于組織病理學結果主要用于確定病變性質和程度，而不是用于確定病變的范圍，也為了減少不必要的工作量，提高檢驗效率，沒有必要廣泛取材，只需要在肉眼觀察病變最顯著的部分，平行和垂直于肌肉走行取兩塊組織即可。

(5)制片：脫水，石蠟包埋，3~5um的切片，伊紅蘇木素染色，封片。

(6)組織病理學檢查方法：主要從四個方面觀察，并對各觀察項按照半定量的方法在《家兔肌肉刺激試驗鏡檢記錄》(見表9-1)中，分別記錄各病變的性質及其程度(輕

度，中度，重度)。

建議主要從肌纖維，肌束，肌束間質，以及血管、神經纖維四個方面觀察。比如，觀察肌纖維有無變性、壞死、溶解，炎細胞浸潤，出血等病變，以及各病變的分布范圍是局限于少數肌纖維，還是多發，或是彌漫。觀察上述病變是局限在一個肌束內，還是發生于多個肌束，并注意觀察各肌束的病變程度。觀察有無間質水腫、間質增寬，以及有無炎細胞浸潤，出血灶等病變。觀察有無充血或出血，血管內皮至外膜各層有無病變，有無血栓形成，神經纖維有無損傷等。

6. 判定方法以組織病理學診斷為主要依據

由于實際操作中，進針可能刺穿肌肉中的血管，而引起非藥物因素的出血等變化，物理性因素與藥物因素引發的肌肉局部刺激性反應單靠肉眼觀察無法確認和鑒別，通過組織病理學檢查可以區分，因此，將組織病理學診斷作為肌肉刺激性試驗結果的主要判定依據，才能根據病變的性質、程度等，、科學地反映引發肌肉病變的原因。

例如，在肌肉刺激性試驗的實際工作中，注射生理鹽水的陰性對照組，有時也會因為進針而造成血管損傷，形成肌肉內較大的出血灶，肉眼可見顏色變深，較難區別于藥物因素引起的肌肉刺激性病變。此問題通過組織病理學像的特點進行區別。

圖9-1中，9-1-1生理鹽水注射組：可見輕-中度淋巴樣細胞浸潤，伴有小灶狀肌纖維變性壞死。兩種病變相比較，淋巴樣細胞浸潤的病變明顯，肌纖維的變性壞死輕微；9-1-2碳酸氫鈉注射組：肌纖維灶狀變性壞死，組織崩解，伴有輕度淋巴樣細胞浸潤，肌束間質水腫。相對于明顯的組織壞死，淋巴樣細胞浸潤輕微，為碳酸氫鈉注射液的藥物毒性作用引起。

因此，建議把組織病理學診斷作為決定性的主要依據，大體觀察僅作為試驗結果判定的參考項目。最終根據肌肉局部肌纖維變性壞死的病變程度為主，結合藥理作用，衡量該刺激性反應與臨床治療目的的矛盾關系，決定該藥物是否可以應用于臨床，以及指導藥物研發改進，減少肌肉刺激性反應。

詳實的實驗方法，不僅為初次開展本試驗的機構和人員提供明確、可操作的實驗方法指導，而且，保障不同的實驗室、不同的實驗人員都能獲得較一致的安全評價檢驗的實驗結果，保障客觀、科學地評價藥物的安全性和有效性。

二、肌肉刺激性試驗的不同實驗方法比較及建議

為保障注射液、注射用粉針劑等肌肉注射類藥物以及一些靜脈注射類藥物(如核磁共振的造影劑)等臨床用藥的安全、有效，在新藥開發研制和新藥申報中，安全性評價是必需的。其中，藥物對注射部位肌肉的局部刺激性試驗是一項重要的檢查項目。

我國已有一些實驗方法被廣泛使用，但內容多屬于指導性原則，較簡約，未對實驗細節做進一步詳細描述，在形成嚴格、規范的肌肉刺激性試驗的安全性評價檢驗方面需進一步深化。日本在20世紀70年代，以肌肉注射引發的大腿股四頭肌攣縮癥的醫療事故為契機，厚生省于1979年頒布了關于注射用藥的局部障害性試驗方法的草案，并于1984年推出了更加完善、合理的注射用藥的局部刺激性試驗的實驗方法的修改案。該方案在日本一直被廣泛使用，具有參考和借鑒價值。

1. 實驗動物

日本原則上選用體重在2.5~3.5kg的白色家兔，必要時，根據情況也可使用較幼小的家兔、犬、大鼠等。近期也有用小型豬的樹脊肌成功進行肌肉刺激性試驗的研究。在藥物的安全性評價中，好選用對注射劑的反應模式(如對藥物的吸收和感受性等)與人體相似的哺乳動物，但是，很多情況下較難達到這一要求。為了能順利實施試驗，原則上選用白色家兔，理由是家兔的股四頭肌的大小較適合肌肉注射以及檢查，而且也易于進行注射部位的肉眼觀察。目前，白色家兔在國際上被廣泛使用于肌肉刺激性試驗。

我國在該試驗中也是家兔，其次可選用大鼠，并規定家兔體重2.5~3.0kg，大鼠體重250~300g為宜。根據實驗需要，科學、合理地選用動物，同時也考慮到實驗成本，建議以白色家兔和大鼠為宜。

對于實驗動物的性別，雖雌雄不拘，但是，日本明確指出在同一實驗中，選用單一性別，不要雌雄混合使用；而我國則沒有這樣的限定，只提出家兔宜單籠飼養，大鼠宜雌雄分籠飼養。對于每個實驗條件組的動物數量，日本規定在3只以上，而我國要求不少于2只。考慮到動物的個體差異，盡可能減少對實驗結果的影響，有必要多使用不同動物的肌肉進行實驗，因此，建議每組3只以上為佳(見表9-2)。

2. 實驗設計

受試物原則上使用臨床應用制劑，兩國在該點上一致。陰性對照組日本規定注射生理鹽水；我國要求設生理鹽水或溶劑作對照。在日本新藥申報的報告中，則可見溶劑需要作為又一個受試物，以生理鹽水注射為陰性對照，做獨立的肌肉刺激性試驗。日本明確規定陽性對照組，使用蒸餾水配制的0.425W/V%以及1.7W/V%的醋酸溶液。理由是已經證明這兩個濃度的醋酸不僅可以對肌肉造成明顯的2個不同程度的損傷，而且再現性很高，加之該溶液易于配置。我國還沒有關于設立陽性對照組的實驗要求。由于不同的實驗人員對同一現象的程度存在判定差異，同一個實驗人員在不同實驗中也會出現診斷游移，為獲得較客觀、的實驗結果，有必要設立相對穩定且再現性高的陽性對照組(見表9-2)。

另外，日本的肌肉刺激性試驗的實驗方法修正案只規定了一次性肌肉注射，而我國則還提出可根據受試物擬用于臨床應用的情況決定給藥期限，多次給藥不超過7天。考慮到臨床前試驗終歸要服務于臨床應用的宗旨，以及動物實驗要盡量接近在人體使用藥物的情況，認為我國的單次和多次給藥的肌肉刺激性試驗的實驗設計優于日本的只有單次給藥的實驗設計(見表9-3)。

日本規定觀察時期為給藥后2天以及14天，麻醉下，放血處死動物，進行檢查。因為注射2天后的觀察有利于了解藥物肌肉刺激的變化過程，而注射14天后的觀察是有利于了解肌肉刺激反應的持續狀況的重要檢查，強調這兩個時間點的觀察都很必要。而我國則只要求末次注射后2天處死動物，進行檢查。作為新藥開發和申報的重要數據，建議進行這兩個或者其他時間點，如給藥后2天和7天，甚至更多的時間點進行觀察，如給藥后2天，7天，14天和21天，以期實現完整、的安全性評價。對于已上市藥物的監管等抽樣調查時，可根據情況進行調整(見表9-3)。

3. 實驗操作

注射劑量的設置，日本的原則為受試物使用成人臨床一次用量的1/2，但是上限為1ml的總注射量，并補充說明如果很難實施1/2的成人一次用量時，可根據本實驗原則自行設計；生理鹽水與受試物溶劑相同；0.425W/V%以及1.7W/V%的醋酸溶液的注射量固定為1ml。

我國對注射劑量的要求較靈活、寬泛，一般可采用與臨床制劑相同的濃度，或者高于臨床劑量，也可根據臨床用藥方案和動物情況等，調整給藥容積及速率。由于采用與臨床相同或更高的濃度，對藥物的安全性要求更高，有利于臨床安全用藥，同時考慮到家兔肌肉所能承受的注射液容量，容量對肌肉組織產生的張力等影響因素，以及便于在相同條件下判定結果，建議在一次較大劑量不超過1ml的前提下，盡可能使用與臨床相同濃度或更高濃度(見表9-3)。

日本不僅規定無菌操作注射，注射部位選擇家兔股四頭肌的中央部，同我國的做法一致，并且詳細注明要垂直進針，刺入1cm，并要求緩慢推注，1ml溶液需10秒鐘，注射后迅速拔針。為了避免注射以外的刺激因素，不對注射部位進行臨床上使用的注射部位的按摩。這些看似繁瑣的規定，不僅是保障不同的實驗室、不同的實驗人員都能獲得較一致的安全評價檢驗的實驗結果，而且極其有利于初次開展本試驗的機構和人員得到明確、可行的實驗方法指導，值得借鑒。

此外，對于注射部位，日本明確提出實驗動物一側股四頭肌注射受試物，另一側可以注射生理鹽水作為陰性對照，但是，陽性對照的醋酸溶液則不能，因此，陽性對照組需要另設一個實驗組。

4. 病理學檢查方法

檢查項目包括大體檢查和組織病理學檢查。日本厚生省頒布的檢查方法如下：

對于大體檢查，在實驗動物的大腿前側，從膝關節至腹股溝切開皮膚，將股四頭肌的筋膜切開后，用鈍器分離股四頭肌，并取出。對摘取的股四頭肌進行如下兩項觀察：

(1)沿肌肉走行縱向切開，注意要在表面能觀察到的變化的最顯著部分。觀察肌肉縱切面的變化，如是否有出血、白色變化、褐色變化等，并測定該病變的長徑和短徑，計算出病變面積。

(2)根據需要，將肌肉組織用10%福爾馬林固定，以供組織病理學檢查。組織病理學檢查在注射14天后可見到大體改變時進行，特別是要重視廣泛的壞死和纖維化。另外，組織病理學檢查的標本不應該局限在小范圍，而是應該廣泛取材。

我國則要求對觀察注射部位肌肉的刺激性反應，并做局部組織的組織病理學檢查。

總結實際工作心得并結合多年的病理學研究工作，由于實際操作中，進針可能刺穿肌肉中的血管，而引起非藥物因素的出血等變化，因為在記錄大體觀察結果的同時，應該進行組織病理學檢查，并以組織病理學的診斷結果為準，判斷藥物對肌肉的刺激性。由于組織病理學結果主要用于確定病變性質和程度，而不是用于確定病變的范圍，因此，沒有必要廣泛取材，而只要把病變最顯著的部分，平行和垂直于肌肉走行取兩塊組織即可。

5. 判定方法

日本厚生省1984年頒布的注射劑肌肉刺激性試驗方法的修正案和中國均有各自的判定方法，對肌肉刺激性反應進行分級。在多年的新藥研制申報的安全性評價檢驗以及動物實驗方法研究中，很多研究人員及學者對判定方法做了有益的探索，對大體病理檢查和組織病理學檢查提出了各自的觀察要點，并不同程度地被應用到實際藥品檢驗及科研工作中(見表9-4)。

在肌肉刺激性試驗的實際工作中，作者發現即使只是注射生理鹽水的陰性對照組，有時也會因為進針而造成血管損傷，形成肌肉內較大的出血灶，其肉眼所見以為顏色變深，較難區別于藥物因素引起的肌肉刺激性病變。此問題通過組織病理學像的特點，可見陰性對照組以出血和大量密集在出血灶的炎細胞浸潤，而肌纖維的變性壞死較輕；由藥物引發的肌肉刺激性反應則以肌纖維的變性壞死為主，病灶內可見散在的多少不等的炎細胞浸潤及紅細胞，從而可以區分。因此，建議把大體觀察僅作為試驗結果判定的參考項目，而把組織病理學診斷作為決定性的依據。

組織病理學檢查，建議以肌肉的病理變化為主，按照以下四個層次觀察，并對各觀察項按照半定量的方法分別記錄各病變的性質、程度及范圍：

(1)肌纖維：觀察有無變性、壞死、溶解、炎細胞浸潤、出血等病變，以及各病變的分布范圍是局限于少數肌纖維，還是多發，或是彌漫。

(2)肌束：觀察上述病變是局限在一個肌束內，還是發生于多個肌束，并注意觀察各肌束的病變程度。

(3)肌束間質：觀察有無間質水腫、間質增寬，以及有無炎細胞浸潤、出血灶等病變。

(4)血管、神經纖維：觀察有無充血或出血，血管內皮至外膜各層有無病變，以及有無血栓形成，神經纖維有無損傷等。

通過分析上述組織病理學改變，不僅可以得出藥物是否有肌肉刺激性，而且通過分析肌肉組織損傷的病理學特點，有助于進一步探討該藥物的毒理機制。