引論：我們?yōu)槟砹?3篇干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文，供您借鑒以豐富您的創(chuàng)作。它們是您寫作時(shí)的寶貴資源，期望它們能夠激發(fā)您的創(chuàng)作靈感，讓您的文章更具深度。
篇1
應(yīng)用IV型膠原快速粘附法從手術(shù)切除的人包皮組織中分離表皮細(xì)胞中的快速粘附細(xì)胞，這一群細(xì)胞被認(rèn)為是表皮干細(xì)胞，它具有快速粘附、緩慢生長的特點(diǎn)[2]。取年齡在5～25歲無泌尿系統(tǒng)感染患者的包皮皮片，無菌條件下去除皮下脂肪層，用含青霉素、鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗皮片數(shù)次，修剪成大小約0.5 cm×0.5 cm的皮片，置于培養(yǎng)皿中，加入0.25%中性蛋白酶10 ml，4℃消化l4～16 h，吸棄上清，分離表皮和真皮層。剪碎表皮，用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，37℃，10 min，加入含有10%胎牛血清的DMEM終止消化，反復(fù)吹吸至細(xì)胞懸浮，200目篩網(wǎng)研磨過濾。濾液經(jīng)1 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞。加入表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基(每100 ml KSFM培養(yǎng)基加入0.05 mmol氯化鈣100 μl、HKGS添加劑1 ml)并輕柔吹打制成單細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先鋪有Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶中，37℃孵育15 min。倒置鏡下觀察，粘附在Ⅳ型膠原被膜上的細(xì)胞為表皮干細(xì)胞，吸出細(xì)胞懸液，用DHank’s液洗2次，加入表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d換液1次，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長，2～3 d內(nèi)細(xì)胞開始分裂，4～5 d后會(huì)出現(xiàn)許多細(xì)胞克隆或集落。培養(yǎng)基中鈣離子的濃度是保持人表皮干細(xì)胞既增殖又不分化的關(guān)鍵。鈣離子濃度過低，會(huì)導(dǎo)致所培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞生長緩慢或不生長;若鈣離子濃度過高，則加速了細(xì)胞分化。我們在實(shí)驗(yàn)中篩選出適合的培養(yǎng)基中鈣離子濃度，可以保證有效的培養(yǎng)維持。在培養(yǎng)過程中，還要經(jīng)常檢查培養(yǎng)箱溫度和CO2的濃度，過低或過高的溫度和CO2含量都影響人表皮干細(xì)胞的生長，容易出現(xiàn)細(xì)胞老化和衰退現(xiàn)象。為了避免各種細(xì)菌、真菌污染培養(yǎng)箱，每周用75%的酒精擦洗箱內(nèi)的托盤、格架、箱壁。托盤始終裝有一定量的飽和濃度磷酸氫二鈉(Na2HPO4)液體，細(xì)菌既不能在其中生長，也能提供合適的濕度[3]。
2 人表皮干細(xì)胞的傳代
當(dāng)原代細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，需進(jìn)行傳代，否則細(xì)胞會(huì)沒有足夠的生長空間，也會(huì)因?yàn)闋I養(yǎng)耗竭而影響生長[4]。用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞，置37℃溫育5 min，必須經(jīng)常在顯微鏡下觀察細(xì)胞被消化的情況，若細(xì)胞部分漂浮起來，即可終止消化。加入2 ml終止液，用吸管反復(fù)輕輕吹打貼壁細(xì)胞，使其形成細(xì)胞懸液，按1∶2傳代。傳代細(xì)胞接種于IV型膠原預(yù)鋪的培養(yǎng)瓶中。
3 人表皮干細(xì)胞的凍存
細(xì)胞不用或保種時(shí)，可將細(xì)胞冷凍保存在液氮中。細(xì)胞在培養(yǎng)基中直接降溫冷凍，可因細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境中的水而形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列變化，如機(jī)械損傷、滲透壓改變、蛋白變性等，從而引起細(xì)胞死亡。因此，細(xì)胞培養(yǎng)基中要加入保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油。為保持細(xì)胞最大存活率，凍存時(shí)要遵循“慢凍快融”的原則。一般用第2代人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)，用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞配成5×106 /ml 的細(xì)胞懸液，1 000轉(zhuǎn)/min，離心10 min，棄去上清，加入1～2 ml 含有10%DMSO的凍存液，用吸管小心吹打，重新懸浮細(xì)胞，分裝于2 ml凍存管中，將蓋擰緊，用記號(hào)筆記好細(xì)胞名稱、細(xì)胞代數(shù)、凍存日期、操作人等。放入-70℃冰箱過夜后，再轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。注意：用于凍存的細(xì)胞應(yīng)在光鏡下觀察生長狀態(tài)良好，凍存細(xì)胞的體積不要超過凍存管體積的1/2。
4 人表皮干細(xì)胞的復(fù)蘇
從液氮中取出凍存管后，迅速投入預(yù)先準(zhǔn)備的40～42℃水中，并不時(shí)搖動(dòng)，讓細(xì)胞凍存液快速解凍1 min左右。取出凍存管，用75%酒精擦拭消毒外壁后，吸出細(xì)胞懸液，加至10 ml離心管中，補(bǔ)加含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，小心吹打使細(xì)胞分散懸浮。1 000轉(zhuǎn)/min，低速離心10 min，棄去上清，加入表皮干細(xì)胞用的條件培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后，轉(zhuǎn)入IV型膠原預(yù)鋪的培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2飽和水蒸汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。復(fù)蘇后要每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長至適當(dāng)密度時(shí)，及時(shí)分瓶培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)待用。
人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速，但諸如細(xì)胞在體外培養(yǎng)容易變形，多次傳代后細(xì)胞克隆形成率明顯下降，細(xì)胞逐漸分化難以保持原代細(xì)胞特性等問題，還有待更好地解決。
參考文獻(xiàn)
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篇2
壓力性尿失禁(SUI)為女性的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率約為1 S%-6O%，多發(fā)生于老年人，因受經(jīng)濟(jì)、宗教、教育程度等因素的影響，其實(shí)際發(fā)生率比統(tǒng)計(jì)發(fā)病率更高。SVl的癥狀嚴(yán)重與否都不自接危及生命，但它給患者的日常上作、生活及社交活動(dòng)造成一定程度的影響，甚至?xí)?yán)重影響患者的生活質(zhì)量乃至家庭和睦。
1臨床資料
注射療法是將藥物、化學(xué)制劑或自體組織等注入后尿道或膀肌頸內(nèi)口粘膜下，使尿道腔變窄、拉長，延長功能性尿道的長度，提高尿道阻力，起到關(guān)閉尿道內(nèi)口和后尿道的作用，從而達(dá)到有效控制排尿的口的。這一治療方法對尿道內(nèi)括約肌功能障礙、尿道內(nèi)壓降低同時(shí)尿道、膀肌無其他病變等壓力性尿失禁患者有較好的效果。注射療法主要優(yōu)點(diǎn)在于.以在局部浸潤麻醉下進(jìn)行操作，大多數(shù)患者的手術(shù)均.IJ.以在門診進(jìn)行，適用于老年及不能耐一受大手術(shù)的患者。口前注射療法的研究主要集中在選擇不同的注射材料上，理想的注射材料應(yīng)該在結(jié)構(gòu)上完整，無毒、無免疫原性、無變應(yīng)原性，近期內(nèi)不會(huì)被分解，能長時(shí)間保持其支撐作用。口前使用的材料尚難達(dá)到上述要求，因此尋找一種取材方便、生物相容性好、安全無毒、療效滿意的注射材料十分必要。
方法：無菌技術(shù)下獲取SD大鼠雙側(cè)腹股溝區(qū)脂肪墊，消化離心，長期培養(yǎng)的方法獲取脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定其表面分子標(biāo)志。SD大鼠24只分為3組，實(shí)驗(yàn)組（6只），對照組一（3只），對照組二（3只）。分別獲取自體ADSCs，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行熒光標(biāo)記。然后實(shí)驗(yàn)組將熒光標(biāo)記的ADSCs自體移植至尿道周圍，對照組移植未并取尿道組織進(jìn)行HE染色組織學(xué)分析。
2結(jié)果
原代培養(yǎng)顯示培養(yǎng)的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞2d左右開始壁,10d-14d左右可達(dá)90%融合,基本上為梭形成纖維樣細(xì)胞形態(tài),免疫細(xì)胞化學(xué)示 CD29陽性，CD34陰性。神經(jīng)切斷術(shù)后10天，除模型組和對照組一各有1只大鼠死亡外，均進(jìn)行尿流動(dòng)力學(xué)檢測，三組手術(shù)前后ALLP分別為：對照組一為27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，對照二為29.5±4.9和27.4±72.3,模型組為24.8±3.8和14.7±3.0。模型組手術(shù)后ALLP明顯降低，且組織學(xué)檢查亦證明模型組大鼠尿道周圍括約肌明顯萎縮。
3討論
本實(shí)驗(yàn)將熒光金標(biāo)記的脂肪源性干細(xì)胞自體移植至大鼠的近端尿道周圍，行冰凍切片，組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡下觀察.見熒光標(biāo)記的細(xì)胞呈金黃色:后取組抗體免疫移植部位有較多的Desmin陽性的細(xì)胞，棕黃色，部分出現(xiàn)一定的方向性，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，說明己有細(xì)胞在局部存活并生長，提示能成為壓力性尿失禁注射治療的一種理想的注射材料，為將來進(jìn)行細(xì)胞移植治療壓力性尿失禁提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
結(jié)論：①大鼠脂肪組織中含有豐富的多能干細(xì)胞。利用消化離心，長期培養(yǎng)的方法可獲取大量的干細(xì)胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周圍成活并生長分化。
參考文獻(xiàn)
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篇3
1選取花蕾
一般在天氣晴朗的8~10時(shí)取材,如遇陰雨天氣,為了不影響試驗(yàn)進(jìn)程也可取材,但一定要選取生長良好的花序,研究報(bào)道低溫有利于小孢子的胚胎發(fā)生。盡量選取主花序或生長狀態(tài)較好的花序,然后在實(shí)驗(yàn)室選取大小在2.5~3.5mm的花蕾備用。不同的材料花蕾的發(fā)育時(shí)期不盡相同,可以剝蕾挑取小孢子進(jìn)行鏡檢以確定發(fā)育時(shí)期,最佳時(shí)期為單核晚期至二核期。花藥為淡綠色呈透明狀。取蕾以后如果不能立刻進(jìn)行小孢子的提取,應(yīng)將花蕾放置于濕潤的條件下低溫保存。
2游離小孢子分離
先用75%的醫(yī)用酒精將花蕾表面滅菌30～60s,再用0.1%升汞消毒花蕾表面15min,再用無菌水沖漂洗3次,每次5min。將消毒的花蕾置于滅過菌的玻璃管中,加約2ml b5提取液,用滅菌玻璃棒將花蕾研碎,壓出花粉小孢子,通過2層槽式無菌濾紙,或45μm的尼龍網(wǎng),或0.22μm孔徑的微孔濾膜過濾,把濾液倒入滅菌了的帶蓋的10ml離心管里,用滴管吸b5抽提培養(yǎng)液沖洗過濾器中的花粉,沖2~3次后,在10ml離心管中將花粉懸浮液稀釋;將花粉懸浮液離心,800rpm,離心5min;將離心管中的上層清液吸去,再加液體b5抽提液,并將沉淀的花粉用吸管沖散,再次懸浮離心(用封口膜封口),1 800rpm,離心5min,吸去上層清液。
3小孢子加倍培養(yǎng)
將沉淀的花粉用nln-16 液體培養(yǎng)基稀釋,稀釋不要超過10ml,因?yàn)榧颖逗筮€要在10ml的離心管中再次稀釋離心,倒入三角瓶在32℃條件下暗培養(yǎng)2d左右(48~72h);然后檢查是否有污染,如果沒有污染,則分皿繼續(xù)培養(yǎng)。
4胚誘導(dǎo)培養(yǎng)
將加倍后的nln-16花粉懸浮液倒入離心管離心,800rpm,離心5min,倒掉nln-16液體;將沉淀的花粉用nln-13培養(yǎng)液稀釋,稀釋后的懸浮液分裝入7.5cm培養(yǎng)皿,一般每皿加入懸浮液3ml左右,含花蕾1.5~2.0個(gè)/ml,小孢子密度為10~50萬個(gè)/ml,用封口膜封口;將封口的培養(yǎng)皿在25℃的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng),10d左右開始查看是否有可見的顆粒狀胚,如果沒有則繼續(xù)培養(yǎng)[2]。
5胚狀體培養(yǎng)
當(dāng)肉眼可見的小胚狀體出現(xiàn)時(shí),把培養(yǎng)皿放在搖床上振蕩暗培養(yǎng)5~7d,轉(zhuǎn)速為80～100rpm。然后將魚雷形、子葉形胚狀體移植到b5固體培養(yǎng)基上,在25℃光暗交替條件下持續(xù)培養(yǎng),誘導(dǎo)植株再生[3]。
6再生苗培養(yǎng)
培養(yǎng)1~2周后,見到子葉長大變綠,胚根伸長,長滿白色根毛。繼續(xù)培養(yǎng)后形成真葉,胚根不再伸長。當(dāng)達(dá)到3～4片真葉時(shí),再轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根,或在附加1mg/l 6-ba的b5培養(yǎng)基上進(jìn)行扦插繁殖,獲得完整植株。
7再生植株倍性鑒定
對再生植株進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定(染色體數(shù)目)或在開花以后根據(jù)花器形態(tài)(雄蕊和花瓣形態(tài))進(jìn)行鑒定[4-7]。若是單倍體植株,需要再加倍培養(yǎng)成雙倍體,可以把帶有秋水仙堿溶液的脫脂棉蓋在植株的頂芽、腋芽上;或者初花期把單倍體植株從土壤中取出,洗凈根部泥土后用0.2%～0.4%秋水仙堿溶液泡1.5～8.0h,再移栽田間;或者胚狀體再生獲得的試管苗,在含10～100mg/l秋水仙堿的b5液體培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)4～8d,轉(zhuǎn)到無秋水仙堿的b5培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～14d,然后移栽到土壤中[8,9]。
8參考文獻(xiàn)
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篇4
METHODS: The tissue of ciliary body of postnatal 10 days rat was isolated and pided into small bits， then cultivated with nonserum DMEM/F12 medium， 20μg/L bFGF， 20μg/L EGF and 1×B27 supplement at the same time， the embryonic brain derived neural stem cells (NSC) were isolated and cultivated with routine method as positive control. These two kinds of cells were identified by detection of nestin with immunofluorescence method， which was known as a marker of neural stem cells. The characteristic of differentiation of RSC was identified in the induced condition of 100mL/L FBS medium.
RESULTS: In the primary cultivation， cell spheres with high refraction were observed 48 hours after isolation and cultivation. The cell spheres enlarged and the amount increased gradually in the fourth or fifth day of cultivation. The passage of the cells occurred in the seventh day of cultivation， and the cells of the next passage can also formed the sphere shape. The marker nestin was detected both in RSC and NSC by immunofluorescence method. The RSC became adherent with the bottom of the culture dish in the induced condition with serum， and some of the cells differentiated into cells with neural cell shapes. The characteristics of the shape， proliferation and differentiation of RSC were similar with NSC.
CONCLUSION: Tissue cultivation has the characteristics of less damage and convenience， which can be used in the isolation and cultivation of RSC successfully.
視網(wǎng)膜干細(xì)胞(retinal stem cell， RSC)是近年來發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞之一。RSC在體外培養(yǎng)中可自我更新和增殖，亦具有多向分化的潛能，可在一定條件下誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。RSC在體外培養(yǎng)、分化與移植方面的研究進(jìn)展為我們最終應(yīng)用這些研究成果來有效的治療致盲性眼病帶來了希望，因而，成功對其進(jìn)行分離，體外培養(yǎng)及鑒定則為進(jìn)一步研究其分化機(jī)制及細(xì)胞治療、基因治療奠定基礎(chǔ)。圖1原代干細(xì)胞(IM×100) A:視網(wǎng)膜干細(xì)胞;B:神經(jīng)干細(xì)胞。圖2Nestin免疫熒光染色陽性(IF×100) A:第2代視網(wǎng)膜干細(xì)胞;B:第2代神經(jīng)干細(xì)胞。
1材料和方法
1.1材料
孕18d Wistar大鼠及出生10d鼠，由吉林大學(xué)動(dòng)物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)，B27添加劑(Invitrogen公司)，胰蛋白酶、EDTA(Sigma公司)，神經(jīng)巢蛋白(nestin)兔抗大鼠多克隆抗體，F(xiàn)ITC羊抗兔抗體(武漢博士德公司)， CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，倒置相差顯微鏡( Olympus)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)等。
1.2方法
將出生10d的Wistar鼠斷頸處死后置于750mL/L乙醇中消毒5min，取出眼球，浸泡于DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。更換新的無菌器械，在解剖顯微鏡下，首先剔除眼球外組織及視神經(jīng)，在角鞏膜緣后3～4mm處環(huán)形剪開眼球，仔細(xì)去除晶狀體、玻璃體及視網(wǎng)膜。取出睫狀體組織放入另一無菌皿內(nèi)，應(yīng)用微觀剪刀盡量將組織剪成碎塊，加入DMEM/F12培養(yǎng)液吹打均勻，移入24孔板中培養(yǎng)，并于孔板中加入20μg/L大鼠表皮生長因子(EGF)，20μg/L大鼠堿性成纖維生長因子(bFGF)及1×B27添加劑，于37℃，50mL/L CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每天以倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長狀況。當(dāng)細(xì)胞形成較大團(tuán)體時(shí)予以傳代，首先離心收集細(xì)胞，用2.5g/L含有EDTA的胰蛋白酶500μL消化細(xì)胞約2min，以含100mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液中止消化，用移液槍吹打使細(xì)胞分散，離心去上清后，應(yīng)用DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌1遍，按1∶2比例傳代，每3d半量換液，約7d傳代1次。應(yīng)用免疫熒光法對RSC及對照組神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。分別應(yīng)用多聚賴氨酸處理的玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片，取出玻片，以0.1mol/L PBS沖洗1次，應(yīng)用40g/L多聚甲醛固定20min，以PBS沖洗5min×3次，2g/L Triton 100作用10min，0.1mol/L PBS洗4min×3次，加入血清室溫封閉20min，傾去血清，加入一抗 (1∶100)孵育過夜(4℃)， PBS洗3次，每次5min。空白對照用PBS代替一抗。加入FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體，避光室溫放置30min，0.1mol/L PBS洗3次，每次5min。中性樹脂封片，熒光顯微鏡下觀察。另取孕18d大鼠，脫頸處死后浸泡于750mL/L乙醇5min。用碘酊及750mL/L乙醇進(jìn)一步消毒小鼠腹部，無菌器械剪開孕鼠腹部皮膚，取出受孕的子宮，移入呈有PBS液的培養(yǎng)皿中。PBS液沖洗兩遍，剪開離體的子宮，取出胚胎，應(yīng)用眼科剪剪開頭骨，小心將腦組織移入另一培養(yǎng)皿中，應(yīng)用DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗，去除腦膜及血管，并應(yīng)用微觀剪刀將組織剪碎，移入加有1mL 2.5g/L含有EDTA的胰蛋白酶的離心管內(nèi)，置于37℃下消化15min，每5min振蕩1次。加入含有100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，離心棄上清，應(yīng)用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌1遍，200目篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，以密度為109 /L將細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)條件同RSC。收集第2代RSC及神經(jīng)干細(xì)胞，應(yīng)用含100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，37℃，50mL/L CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察其分化情況。
2結(jié)果
2.1大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞
分離培養(yǎng)48h后開始在組織塊旁出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)，大小不一，由數(shù)個(gè)單個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，折光性強(qiáng)，呈球形或者桑葚狀懸浮生長(圖1A)。培養(yǎng)至4～5d后，懸浮生長的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量逐漸增多、增大。原代細(xì)胞培養(yǎng)至6～7d細(xì)胞團(tuán)數(shù)量達(dá)到高峰。傳代時(shí)去除組織塊及雜細(xì)胞，48h即可形成新的細(xì)胞團(tuán)，形態(tài)與原代相似，隨傳代次數(shù)增加細(xì)胞團(tuán)數(shù)目增加逐漸變緩。取第2代RSC及神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行nestin免疫熒光染色，鏡下可見RSC呈現(xiàn)陽性的綠色熒光，空白對照組無熒光顯示(圖2A)。神經(jīng)干細(xì)胞nestin免疫熒光染色亦顯示出陽性綠色熒光，與RSC表現(xiàn)相似，空白對照組無熒光顯示(圖2B)。
2.2大鼠神經(jīng)干細(xì)胞
胎鼠腦組織細(xì)胞懸液培養(yǎng)孔內(nèi)可見培養(yǎng)48h后多數(shù)細(xì)胞團(tuán)形成，折光性強(qiáng)，呈球形或者桑葚狀懸浮生長(圖1B)。培養(yǎng)至4～5d后，懸浮生長的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量增多，出現(xiàn)較大的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)間可見融合現(xiàn)象。原代細(xì)胞培養(yǎng)至6～7d細(xì)胞團(tuán)數(shù)量達(dá)到高峰。傳代后48h形成新的與原代相似的細(xì)胞團(tuán)。與RSC相比，其細(xì)胞團(tuán)增殖速度較快。圖3干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞(IM×100) A:視網(wǎng)膜干細(xì)胞;B:神經(jīng)干細(xì)胞。
2.3干細(xì)胞體外的誘導(dǎo)分化
取第2代RSC及神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用含100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化， 3d可見大部分RSC貼壁生長，部分細(xì)胞開始長出小突起， 7～10d細(xì)胞突起逐漸增長成條狀，呈典型的神經(jīng)元形態(tài)(圖3A)。第2代神經(jīng)干細(xì)胞的表現(xiàn)與RSC相似，但其細(xì)胞形成突起更為明顯，其具有神經(jīng)元外觀的細(xì)胞較RSC增多，且細(xì)胞之間連接成網(wǎng)狀(圖3B)。
3討論
在以往的研究中，人們發(fā)現(xiàn)在部分脊椎動(dòng)物的視網(wǎng)膜邊緣，接近睫狀體上皮的結(jié)合部存在著少量的RSC。在魚和兩棲類動(dòng)物中，RSC可終生不斷生長，持續(xù)產(chǎn)生前體細(xì)胞，在原有視網(wǎng)膜的周邊產(chǎn)生新的視網(wǎng)膜，并可在視網(wǎng)膜損傷時(shí)增殖、分化以修復(fù)更新受損細(xì)胞。此外，人們發(fā)現(xiàn)在鳥類視網(wǎng)膜周邊部的睫狀邊緣帶也存在著不斷增殖分化的RSC，但其產(chǎn)生新生視網(wǎng)膜的能力受到限制[1]。以往認(rèn)為，哺乳動(dòng)物中缺乏RSC，近年來的研究證實(shí)，胚胎鼠視網(wǎng)膜包含著在體外具有干細(xì)胞特性的祖細(xì)胞，這些細(xì)胞除可增殖并表達(dá)神經(jīng)外胚層標(biāo)記外，還具有多向分化潛能[2]，而且隨著研究的不斷進(jìn)展，目前，研究者們已成功的從多種成年哺乳動(dòng)物及人類的睫狀體區(qū)域分離、培養(yǎng)出RSC。這些培養(yǎng)的細(xì)胞具有可自我更新、增殖的能力，在一定條件下可分化成為神經(jīng)細(xì)胞、光感受器細(xì)胞等某些類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞[36]，而且近年來研究證明經(jīng)某些特定基因修飾后視網(wǎng)膜細(xì)胞將向特定類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞分化[79]，RSC的研究進(jìn)展為視網(wǎng)膜發(fā)育的具體機(jī)制研究及視網(wǎng)膜損傷疾病治療帶來了希望。
存在于睫狀體色素上皮層的RSC由于數(shù)量少、部位隱匿，給分離、培養(yǎng)帶來一定的困難。目前對RSC仍沒有固定的分離培養(yǎng)方法，其培養(yǎng)條件多與腦源性神經(jīng)干細(xì)胞相似，為了抑制干細(xì)胞分化常應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，常用的培養(yǎng)基為DMEM/F12(1∶1)。為保證培養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)增殖、更新、保持去分化狀態(tài)，還需要有絲分裂原(常用bFGF及EGF)。而且，還可添加培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞所需的多成分復(fù)合營養(yǎng)物質(zhì)B27或N2以促進(jìn)細(xì)胞生長。目前RSC的分離培養(yǎng)方法主要應(yīng)用機(jī)械酶消化法，即先將組織剪成小塊，再應(yīng)用胰酶等酶類進(jìn)行消化，最終得到單細(xì)胞懸液。但在酶消化過程中，為防止消化過程中細(xì)胞損傷，很難把獲取組織塊完全消化成單細(xì)胞，因此有時(shí)消化所獲得的目的細(xì)胞較少。我們應(yīng)用眼科微觀剪刀將組織盡量剪成小塊，直接置入培養(yǎng)皿內(nèi)并加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，避免了酶消化對于細(xì)胞的損傷，而且簡化了操作步驟，減少了細(xì)胞的流失及實(shí)驗(yàn)污染的機(jī)會(huì)。培養(yǎng)48h即可發(fā)現(xiàn)較小的組織塊周圍開始不斷有細(xì)胞遷移出來，而且在首次傳代時(shí)用吸管吹打就可獲得較多的單細(xì)胞，然后再用濾網(wǎng)過濾即可除去雜質(zhì)，得到較為純凈的細(xì)胞團(tuán)。本實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法從睫狀體區(qū)分離、培養(yǎng)出的細(xì)胞團(tuán)具有自我更新及增殖的能力，且免疫熒光法證實(shí)其與腦源性神經(jīng)干細(xì)胞相似，均表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin，傳代后細(xì)胞的增殖潛能及nestin的表達(dá)無明顯衰減。細(xì)胞在去除生長因子且存在血清的培養(yǎng)條件下與腦源性神經(jīng)干細(xì)胞表現(xiàn)相似，可誘導(dǎo)分化成具有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞，體現(xiàn)了其在一定條件下具有分化能力。因此，我們認(rèn)為，組織塊培養(yǎng)法適合于來源于睫狀體區(qū)視網(wǎng)膜神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，可以從少量實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中較為簡單、快捷的體外擴(kuò)增出大量的細(xì)胞數(shù)目以進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。
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篇5
一、信息技術(shù)發(fā)展對婦幼保健院政工干部培養(yǎng)的影響
1.信息技術(shù)發(fā)展對政工干部素質(zhì)提出了更高的要求
信息技術(shù)的發(fā)展使得信息化素質(zhì)成為政工干部的基本素質(zhì)之一，婦幼保健院的政工干部也不例外。信息化素質(zhì)是指主體所擁有的各種信息品質(zhì)，包括信息智慧、信息道德、信息意識(shí)、信息覺悟、信息潛能和信息心理等內(nèi)容。信息化素質(zhì)能讓政工干部跟上時(shí)展的潮流，掌握最新的信息技術(shù)，也能讓政工干部認(rèn)識(shí)到信息的重要性而自覺地利用信息提高工作質(zhì)量，培養(yǎng)政工干部終身學(xué)習(xí)意識(shí)。婦幼保健院作為醫(yī)療體系的一部分，一些醫(yī)療技術(shù)和醫(yī)療設(shè)備更新速度很快，政工干部必須具備較高的信息化素質(zhì)才能捕捉到這些信息。具體來說，信息技術(shù)的發(fā)展要求婦幼保健院的政工干部全面提高自身素質(zhì)，學(xué)好信息知識(shí)、掌握信息技能的同時(shí)，還要學(xué)習(xí)政工理論知識(shí)、醫(yī)療專業(yè)知識(shí)及人文社科知識(shí)等，培養(yǎng)政工干部的領(lǐng)導(dǎo)管理能力、溝通交流能力等。
2.信息技術(shù)發(fā)展對政工干部素質(zhì)培養(yǎng)提供了新的條件
信息技術(shù)的發(fā)展改變了傳統(tǒng)的信息的載體形式，拓寬了信息傳播的渠道，極大地縮短了信息傳播所需要的時(shí)間，使個(gè)人獲得信息的成本大大降低，為政工干部的培養(yǎng)創(chuàng)造了有利的條件。首先，政工干部學(xué)習(xí)、溝通渠道更廣。婦幼保健院可以在政工干部的培養(yǎng)課程中使用各種計(jì)算機(jī)輔助教學(xué)方式，它使課程內(nèi)容更加生動(dòng)有趣，能更好地激發(fā)政工干部的學(xué)習(xí)興趣；依靠網(wǎng)絡(luò)教學(xué)的方式還可以讓政工干部充分利用網(wǎng)上豐富的信息資源，相互交流學(xué)習(xí)；此外政工干部還可以合理安排自己的學(xué)習(xí)時(shí)間，選擇自己的學(xué)習(xí)方式，培養(yǎng)方式更加個(gè)性化。其次，政工干部利用信息的方式發(fā)生了改變。過去婦幼保健院的政工干部獲取信息主要靠閱讀各種紙質(zhì)材料，現(xiàn)在政工干部閱讀的載體擴(kuò)展到網(wǎng)絡(luò)信息，從文字?jǐn)U展到圖像、聲音、三維等；在表達(dá)方式上實(shí)現(xiàn)了從直接手寫到鍵盤輸入、掃描等，包括直接復(fù)制或者刪減其他文件；在計(jì)算方式上也不再需要人工計(jì)算，利用計(jì)算機(jī)準(zhǔn)確又迅速減輕了政工干部數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的負(fù)擔(dān)。
3.信息技術(shù)發(fā)展對政工干部素質(zhì)培養(yǎng)帶來的問題
首先，信息鴻溝現(xiàn)象比較嚴(yán)重。在婦幼保健院的政工部門中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用現(xiàn)代信息技術(shù)方面也存在較大差異，這給政工干部的信息培養(yǎng)課程增加了不小的難度。其次，網(wǎng)絡(luò)信息量過于龐大。信息技術(shù)的發(fā)展使得，各種信息都能在網(wǎng)絡(luò)上迅速傳播，過量的信息會(huì)使人們很難找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是嚴(yán)重影響政工干部的培養(yǎng)工作。
二、提高婦幼保健院政工干部培養(yǎng)質(zhì)量的對策
1.定期完善政工干部培養(yǎng)方案
信息技術(shù)的發(fā)展變化是日新月異的，婦幼保健院要保證政工干部的培養(yǎng)緊跟時(shí)代的步伐就必須根據(jù)時(shí)代的變化對培養(yǎng)方案和教學(xué)計(jì)劃進(jìn)行全面的調(diào)整和修訂，但是不能改變的是要始終強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)信息化素質(zhì)的重要性。培養(yǎng)方案的完善和修改可以從以下幾方面入手：教學(xué)目標(biāo)、教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)課程專題、教師師資、教學(xué)材料和教學(xué)組織形式等，要突出強(qiáng)調(diào)信息化素質(zhì)的地位。
2.精心設(shè)計(jì)培養(yǎng)的專題體系
婦幼保健院政工干部培養(yǎng)的基本平臺(tái)就是課程專題，怎樣設(shè)計(jì)合理的課程專題也成為政工干部培養(yǎng)工作的難題，可以明確的是必須要依據(jù)信息技術(shù)的發(fā)展對各類政工干部知識(shí)能力素質(zhì)的客觀要求來建立課程專題體系，同時(shí)也要根據(jù)不同教學(xué)對象的性質(zhì)、層次和類型做出調(diào)整。要根據(jù)政工干部的培養(yǎng)目標(biāo)確定專題的類別和課時(shí)比例，各類專題都有圍繞解決新時(shí)期思想政治教育工作來設(shè)計(jì)，專題設(shè)置和內(nèi)容都要做到內(nèi)容精干、素材新穎、實(shí)在管用，不僅要包括信息化知識(shí)和技術(shù)的課程，還要有其他方面的課題。
3.打造政工干部培養(yǎng)的環(huán)境條件保障體系
婦幼保健院可以從以下幾個(gè)方面來支持政工部門的信息化工作。首先，配置完備的教學(xué)設(shè)施設(shè)備，包括計(jì)算機(jī)及網(wǎng)絡(luò)、多功能教室等。其次，建設(shè)多樣的信息化教學(xué)信息資源子系統(tǒng)，例如數(shù)字化圖書館信息資源、課程網(wǎng)絡(luò)信息資源、教學(xué)管理信息資源等。
總之，為了讓信息技術(shù)的發(fā)展更好地為婦幼保健院的政工干部培養(yǎng)工作服務(wù)，需要站在全局的高度將信息技術(shù)理論和方法應(yīng)用到培養(yǎng)的全過程中，需要對政工干部培養(yǎng)的形式、內(nèi)容、方法進(jìn)行深刻變革，以提高政工干部培養(yǎng)的效率，全面提高政工干部信息化素質(zhì)培養(yǎng)的質(zhì)量和效益。
參考文獻(xiàn)：
[1]周軍、夏婷婷，論信息技術(shù)發(fā)展對政工干部培養(yǎng)影響及其對策，中國信息界，2012（05）
篇6
細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)可謂是理想的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方式，懸浮培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應(yīng)器中，在人工條件下，高效率大規(guī)模的培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)而應(yīng)用于生物制品生產(chǎn)的技術(shù)，可根據(jù)細(xì)胞的貼壁能力分為微載體懸浮培養(yǎng)方式和全懸浮培養(yǎng)方式。
1. 微載體懸浮培養(yǎng)。MDCK 細(xì)胞是從犬腎分離出來的一種貼壁依賴性上皮細(xì)胞，且它具有典型的“失巢凋亡”現(xiàn)象，即一種特殊的細(xì)胞程序死亡，是由于細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)或相鄰細(xì)胞脫離接觸而誘發(fā)的，也就是說依靠傳統(tǒng)的馴化方式或者單純的用機(jī)械攪拌使MDCK 細(xì)胞懸浮生長難度相當(dāng)大。Van Wezel 創(chuàng)立的微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)開創(chuàng)了細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)的先河，更為準(zhǔn)確的說是使貼壁細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)成為現(xiàn)實(shí)。微載體懸浮培養(yǎng)是一種先進(jìn)的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，其原理是將對細(xì)胞無害的顆粒加入到生物反應(yīng)器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞能在微載體表面附著生長，同時(shí)加以持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。反應(yīng)器中使用微載體是一種可以提高細(xì)胞濃度的策略，其細(xì)胞密度可達(dá)1×107 cells/ml。
采用微載體培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞，結(jié)合了懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，包括（1）細(xì)胞貼壁表面積大大增加，培養(yǎng)基利用充分，細(xì)胞密度增大。（2）微載體可在攪拌停止時(shí)沉降，便于將培養(yǎng)基與細(xì)胞分離。（3）與方瓶貼壁培養(yǎng)時(shí)的代謝變化不大，正常培養(yǎng)基可通用等等。
但是，目前生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)研究只是單批次的培養(yǎng)，其消化放大培養(yǎng)依舊是難題。且微載體培養(yǎng)過程中一般添加了血清，給下游純化帶來了巨大壓力。采用商業(yè)無血清培養(yǎng)基，會(huì)大大增加企業(yè)生產(chǎn)成本。因此，自主開發(fā)無血清培養(yǎng)基進(jìn)行MDCK 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是目前的發(fā)展趨勢。
2. 無血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。我們知道，生物制品生產(chǎn)尤其是細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)病毒疫苗的過程十分嚴(yán)謹(jǐn)。細(xì)胞培養(yǎng)需添加血清，可是血清的加入無疑給生產(chǎn)后期的除雜純化等工藝帶來難度，而且，流感病毒血凝素HA 可被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1 和HA2，能夠介導(dǎo)病毒囊膜和靶細(xì)胞膜結(jié)合，病毒開始繁殖，而MDCK 細(xì)胞本身不具備裂解HA 的蛋白酶類，所以常常添加胰蛋白酶來提高病毒產(chǎn)量，但是，細(xì)胞培養(yǎng)中的血清恰好又可以中和胰蛋白酶，這種矛盾致使MDCK 無血清培養(yǎng)問題更亟需解決。目前，MDCK 無血清培養(yǎng)已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，基本思路是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上補(bǔ)加各種生物活性因子來替代血清，結(jié)合細(xì)胞生長所需成分，配制出無血清培養(yǎng)基， 能夠支持MDCK 細(xì)胞正常生長增殖。一般常見的營養(yǎng)添加因子有：胰島素，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，氫化可的松等等，再經(jīng)過對這些添加因子的添加量的優(yōu)化，最終確定無血清培養(yǎng)基成分。
現(xiàn)在，已有MDCK 細(xì)胞商業(yè)用無血清培養(yǎng)基，它們的成功問世解決了這一大難題。通過直接法或間接法，即：原含血清培養(yǎng)貼壁細(xì)胞直接消化傳代換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)或逐步降低血清濃度直至降到無血清培養(yǎng)，使MDCK 細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，生長狀態(tài)優(yōu)良且能正常增殖傳代。
完成了MDCK 無血清培養(yǎng)后，MDCK 單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)仍在研究當(dāng)中，有文獻(xiàn)報(bào)道，已有馴化成功的MDCK 懸浮細(xì)胞系，但就市場應(yīng)用來看，是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠成熟的。現(xiàn)階段，馴化MDCK 細(xì)胞在適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)馴化方法主要有以下幾種：（1）使用硅化方瓶培養(yǎng)：將細(xì)胞培養(yǎng)方瓶先用硅化劑處理，防止了細(xì)胞的貼壁，再通過調(diào)整培養(yǎng)基成分，使細(xì)胞增殖；（2）使用搖床或搖瓶體系，通過外力作用，防止細(xì)胞貼壁，再對細(xì)胞進(jìn)行篩選，然后擴(kuò)大培養(yǎng)。
二、 MDCK 細(xì)胞應(yīng)用于流感病毒疫苗生產(chǎn)
采用細(xì)胞系培養(yǎng)流感病毒是目前最有前景的流感疫苗生產(chǎn)方法，市場銷售的一些貼壁細(xì)胞系如Vero 細(xì)胞，MDCK 細(xì)胞是應(yīng)用于流感疫苗研究最典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，經(jīng)研究，這些宿主細(xì)胞產(chǎn)生的病毒滴度高，大部分病毒繁殖效果好。此外，研究表明，從相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗免疫應(yīng)答效果和用雞胚生產(chǎn)的疫苗一樣好。MDCK 細(xì)胞應(yīng)用于流感疫苗生產(chǎn)有很多優(yōu)點(diǎn)：MDCK細(xì)胞易培養(yǎng)、增殖快、易放大，感染流感病毒效率高，可高效擴(kuò)增流感病毒；MDCK 細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗可以應(yīng)用于對雞胚蛋白過敏的患者等等。在使用MDCK 貼壁細(xì)胞接流感病毒后，通常會(huì)有較高的細(xì)胞特異性產(chǎn)率；微載體懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞，接流感病毒后，HA 滴度可以高達(dá)9log2（1∶512）；就已知實(shí)驗(yàn)室用馴化出MDCK 懸浮細(xì)胞系接流感病毒，得出的TCID50 值和HA 滴度都高于貼壁細(xì)胞系。且已有疫苗廠商如Solvay 制藥公司采用無血清培養(yǎng)基、微載體技術(shù)制備出了MDCK細(xì)胞流感亞單位疫苗；諾華公司制備出了由MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的流感疫苗Optaflu。
三、展望
在過去十幾年中，用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備流感疫苗生產(chǎn)方式已經(jīng)替代了傳統(tǒng)的使用雞胚生產(chǎn)方式。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗的特征在于其靈活性和可擴(kuò)展性，然而，貼壁細(xì)胞易培養(yǎng)但是卻很難擴(kuò)大生產(chǎn)量，而如果使用微載體提供生長表面又會(huì)大大增加其成本。所以要努力創(chuàng)建懸浮細(xì)胞系，特別是MDCK懸浮細(xì)胞系。
多年以來，監(jiān)管部門督促行業(yè)設(shè)立無血清培養(yǎng)流程，以避免污染。
然而，許多市售培養(yǎng)基仍然需要添加物，以達(dá)到高細(xì)胞密度和最大產(chǎn)物產(chǎn)量。理想的情況是，在疫苗生產(chǎn)中應(yīng)該使用不需添加另外的蛋白質(zhì)等混合物的已知成分的培養(yǎng)基。這不僅會(huì)降低批次變化的風(fēng)險(xiǎn)也有利于病毒收獲的下游處理。此外，疫苗生產(chǎn)過程可以被簡化，可以直接接毒而不用更換培養(yǎng)基。
篇7
關(guān)鍵詞：乙醇； 肝細(xì)胞； 原代培養(yǎng)； 黃芩莖葉總黃酮； 保護(hù)作用
The Protective Effect of Total Flavonoid in scutellaria baicalensis Stem-Leaf on Primary Cultured Mice Hepatocytes Injured by Ethanol
Abstract：ObjectiveTo study the protective effect of total flavonoid in Scutellaria baicalensis stem-leaf (SSTF) on primary mice hepatocyes injured by ethanol. MethodsPrimary hepatocytes were isolated， cultured by trypsin digestion and induced by ethanol. Various concentrations of SSTF were added to the primary cultured hepatocytes for 12h.The content of malondialdehyde(MDA) in hepatocytes and the activity of ALT in cultural supernatant were determined by general methods，the viabilities of hepatocytes were measured by MTT.ResultsThe elevation of MDA content of hepatocytes and ALT level in supermatant of cultural hepatocyes were restored remarkably by SSTF， hepatocytes viability was improved significantly by SSTF.ConclusionSSTF has a protective action on primary mice hepatocyes injured by ethanol.This might be associated with its anti-lopoperoridation.
Key words：Ethanol; Hepatocytes; Primary cultured; SSTF; Protective effect
肝臟是酒精代謝的主要臟器，過量飲酒可造成肝臟不同程度的損害，并進(jìn)一步發(fā)展為脂肪肝、肝纖維化和肝硬化，嚴(yán)重危害人類健康。了解酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制，篩選有效預(yù)防和治療的藥物應(yīng)用于臨床，是當(dāng)前面臨的重要課題。黃芩莖葉總黃酮(SSTF)是我院中藥所對黃芩的莖葉部分提取的有效成分，整體實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其對肝損傷有保護(hù)作用［1］。本文建立體外乙醇性肝細(xì)胞損傷模型，在細(xì)胞水平上進(jìn)一步研究乙醇性肝損傷的機(jī)制及SSTF對肝細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 藥品與試劑SSTF（含總黃酮73%）：承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提供，臨用前以蒸餾水配制，用飽和碳酸氫鈉調(diào)pH=7.6；Hanks液高壓滅菌，4℃保存；0.8 g?L-1胰蛋白酶：用Hanks液溶解，過濾除菌，調(diào)pH 7.2，分裝，-30℃保存；基礎(chǔ)培養(yǎng)液：RPMI 1 640培養(yǎng)基10.0 g，用超凈水900 ml溶解，5.6%NaHCO3調(diào)pH至7.2，定溶到1 000 ml，過濾除菌，臨用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 u?ml-1，鏈霉素100 μg?ml-1，胰島素5 μg?ml-1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。
1.2 動(dòng)物昆明種小鼠，1~3 d齡乳鼠，雌雄不限，清潔級(jí)，承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供。
1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自動(dòng)生化分析儀（美國Bayer公司），721W微機(jī)型分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠），離心機(jī)（TGL.16G 上海）。
1.4 肝細(xì)胞分離培養(yǎng)［2］取新生小鼠30只，斷頭放血，無菌分離肝臟，置Hanks液中，灌注沖洗肝臟至灰白色，將肝臟剪成1 mm3左右的組織塊，用Hanks沖洗數(shù)次，除去血細(xì)胞，加入0.8 g?L-1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入數(shù)滴血清終止消化，用滴管輕吹打成細(xì)胞懸液，經(jīng)200尼龍篩網(wǎng)過濾后用培養(yǎng)液洗2次，1000 r/min離心5 min，收集肝細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)>85%，按1 ×109個(gè)?L-1，接種于鋪有鼠尾膠原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。
1.5 乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型的建立將含肝細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔板培養(yǎng)24 h更換培養(yǎng)液，設(shè)正常對照組，25，50，75，100 mmol?L-1四個(gè)乙醇組，肝細(xì)胞懸液與不同濃度乙醇繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)液按賴氏法測定ALT活性，TBA法檢測MDA含量，MTT法測定肝細(xì)胞存活率。
1.6 SSTF對誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的作用取上述培養(yǎng)24 h肝細(xì)胞，設(shè)乙醇損傷模型組、SSTF(100，200，300 mg?L-1)3個(gè)劑量保護(hù)組、正常對照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。模型組和SSTF組加入乙醇100 mmol?L-1，同時(shí)SSTF組加入不同濃度的SSTF，正常對照組加不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集培養(yǎng)上清液檢測ALT活性和MDA含量，MTT法測定肝細(xì)胞的存活率。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS11.5計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 組間比較采用t檢驗(yàn)，P
2 結(jié)果
2.1 乙醇對原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的損傷不同濃度的乙醇作用于肝細(xì)胞，對細(xì)胞有劑量依賴性的損傷作用，25 mmol?L-1作用不明顯，光鏡下細(xì)胞形態(tài)基本正常，隨著濃度的增大，肝細(xì)胞存活率呈進(jìn)行性降低，反映肝細(xì)胞損傷的酶ALT逐漸升高；鏡下觀察肝細(xì)胞損傷明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol?L-1乙醇作用最明顯。
表1 不同濃度乙醇對肝細(xì)胞ALT水平及細(xì)胞存活率的影響（略）
與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
2.2 SSTF對乙醇損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用100 mmol?L-1乙醇作用肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞損傷明顯，大量細(xì)胞壞死，細(xì)胞內(nèi)ALT釋放量明顯升高，細(xì)胞內(nèi)MDA含量較對照組明顯增高；而給予SSTF保護(hù)后， ALT水平明顯降低，MDA含量亦明顯降低，肝細(xì)胞存活率明顯升高，并呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.05或P＜0.01)。顯示：SSTF能夠保護(hù)肝細(xì)胞、穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，其保護(hù)作用可能與抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。
表2 SSTF對乙醇損傷肝細(xì)胞ALT，MDA水平及細(xì)胞存活率的影響（略）
與對照組比較，*P＜0.01，與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
3 討論
乙醇本身和它的氧化物乙醛對肝細(xì)胞有直接毒性作用［3］。乙醇進(jìn)入機(jī)體后，在肝細(xì)胞乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、細(xì)胞色素P450等作用下產(chǎn)生氧自由基，氧自由基除直接損傷肝細(xì)胞外，還可通過增加肝細(xì)胞對脂質(zhì)過氧化的敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞器破壞，肝酶逸出，細(xì)胞死亡［4］。ALT是肝細(xì)胞內(nèi)主要酶之一，肝細(xì)胞膜損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ALT釋放量增加，因此檢測培養(yǎng)液中ALT活性是判斷肝細(xì)胞膜損傷最明顯的標(biāo)志［5］，MTT法檢測細(xì)胞存活情況可直接反映細(xì)胞損傷程度，MDA是肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低可反映膜脂質(zhì)過氧化程度的強(qiáng)弱和肝細(xì)胞損傷的程度［6］。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，低劑量酒精對肝細(xì)胞損傷不明顯，ALT水平和MDA含量變化不大，隨著酒精濃度的增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT呈進(jìn)行性升高，細(xì)胞存活率逐漸下降，并且MDA含量也呈現(xiàn)進(jìn)行性增加，表明過量飲酒可引起肝細(xì)胞氧化損傷。為了充分證實(shí)SSTF對酒精性肝損傷的保護(hù)作用，我們以100 mmol?L-1乙醇制備小鼠肝細(xì)胞損傷模型。結(jié)果表明，在酒精損傷的肝細(xì)胞中加入SSTF后，肝細(xì)胞損傷明顯減輕。隨著SSTF劑量增加，培養(yǎng)液中ALT水平逐漸降低，肝細(xì)胞存活率明顯升高，與模型組比較，差別顯著（P
參考文獻(xiàn)
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篇8
被譽(yù)為“試管嬰兒之父”的英國劍橋大學(xué)教授羅伯特•愛德華說：“克隆單純從技術(shù)上講非常簡單，就是把卵細(xì)胞中DNA去掉，然后將體細(xì)胞中的DNA移入其中。這在世界上任何一個(gè)試管嬰兒實(shí)驗(yàn)室中都可以完成，困難在于如何降低克隆的危險(xiǎn)。”
本文以此熱點(diǎn)問題作為命題材料，對2011年高考生物試題進(jìn)行單項(xiàng)預(yù)測。預(yù)測材料及其涉及的知識(shí)、試題如下：
1．試管嬰兒
【知識(shí)鏈接】要做好有關(guān)“試管嬰兒”的試題，除了書本上的知識(shí)外，還要掌握“試管嬰兒”技術(shù)的有關(guān)知識(shí)。“試管嬰兒”技術(shù)是通過將不孕夫婦的和卵細(xì)胞取出在試管中完全受精，并在試管中培養(yǎng)使其發(fā)育到囊胚期，再將胚胎移入女性子宮內(nèi)使其發(fā)育成胎兒。
體外受精步驟包括：的采集與培養(yǎng)、卵母細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)、體外受精等操作技術(shù)。具體過程如下圖:
哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的過程大體概括如下圖：
例1 下列關(guān)于關(guān)試管嬰兒的說法，不正確的是（）
A. 從良種母牛體內(nèi)采集的卵母細(xì)胞都需要進(jìn)行體外培養(yǎng)
B. 從良種公牛采集的需進(jìn)行獲能處理
C. 早期胚胎移植的意義在于提高優(yōu)良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵發(fā)育至原腸胚時(shí)期的胚
解析：本題考查了試管嬰兒的相關(guān)知識(shí)。根據(jù)體外受精和胚胎發(fā)育過程圖解可知，早期胚胎指的是由受精卵發(fā)育至囊胚時(shí)的胚。
答案：D
例2 據(jù)2008年1月17日《干細(xì)胞》雜志報(bào)道，某科學(xué)家使用了進(jìn)行試管受精的年輕女性捐獻(xiàn)的卵子，以及2名志愿者的皮膚成纖維細(xì)胞，成功克隆出了5個(gè)人體胚胎，進(jìn)而可以開發(fā)出有研究價(jià)值的干細(xì)胞。請回答：
（1）上述過程中主要應(yīng)用到的兩項(xiàng)動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)為；若將某經(jīng)過修飾的基因?qū)肫渲械牟糠峙咛ジ杉?xì)胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通常需要加入等天然成分；在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要保證被培養(yǎng)的細(xì)胞處于一定的氣體環(huán)境，所需要的氣體主要有 。
（3）科學(xué)家欲進(jìn)行胚胎分割移植，則應(yīng)該選擇發(fā)育良好、形態(tài)正常的或囊胚，將其移入盛有操作液的培養(yǎng)皿中，然后用分割針進(jìn)行分割。
答案：（1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞核移植顯微注射技術(shù)（法）
（2）血清（血清、血漿） 氧氣和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知識(shí)鏈接】克隆人的基本原理是動(dòng)物細(xì)胞核的全能性，包括胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植。其基本過程為：
細(xì)胞核移植技術(shù)中注入去核卵母細(xì)胞中的不是供體細(xì)胞核，而是整個(gè)細(xì)胞，伴隨著兩細(xì)胞融合，體現(xiàn)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有一定的流動(dòng)性。該技術(shù)形成重組細(xì)胞繼而發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體，體現(xiàn)了細(xì)胞核的全能性而非動(dòng)物細(xì)胞的全能性。
例3 下圖為克隆人的示意圖，據(jù)圖回答：
（1）圖中所涉及的現(xiàn)代生物技術(shù)有、和
等。
（2）下列有關(guān)胚胎移植的敘述正確的有（）
A.沖卵指的是從子宮中沖出胚胎，而非沖出卵子
B.只有供、受體生理環(huán)境高度一致，移入受體的胚胎才能被接受，并繼續(xù)發(fā)育
C.供體和受體要進(jìn)行免疫檢查，防止發(fā)生免疫排斥反應(yīng)
D.不同動(dòng)物其胚胎移植的時(shí)間不同，人的胚胎移植最好在四個(gè)細(xì)胞階段進(jìn)行
（3）圖中兩個(gè)嬰兒長大后，外貌、性格和其他特征與原型男人相同，這說明 具有全能性。
（4）使用培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通常要加入等天然成分，除了保證被培養(yǎng)細(xì)胞處于無菌、無毒及充足氧氣的環(huán)境中，還需要保證細(xì)胞生活所需的；早期胚胎發(fā)育在階段以前的細(xì)胞是全能細(xì)胞。
（5）圖中從“內(nèi)細(xì)胞團(tuán)到胚胎干細(xì)胞”的培養(yǎng)過程中，必須用處理內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，使之分散成單個(gè)細(xì)胞。干細(xì)胞形成組織、器官必須要進(jìn)行 和 。
（6）在體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞能否獲得動(dòng)物器官?
。為什么？
解析：（1）該圖利用了細(xì)胞核移植、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、胚胎分割移植等技術(shù)。（2）沖卵一般是指是胚胎收集中的沖卵――胚胎、早期胚胎。供體和受體只有保證具有相同的生理狀態(tài)，才能保證胚胎的正常發(fā)育。（3）克隆過程說明動(dòng)物細(xì)胞核具有全能性。（4）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的成分包括葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件：無菌、無毒的環(huán)境；營養(yǎng)物質(zhì)（合成培養(yǎng)基）；溫度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；氣體環(huán)境（氧氣和二氧化碳）等。（5）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程常用胰蛋白酶處理組織，以使之分散成單個(gè)細(xì)胞。（6）胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下一般只能增殖進(jìn)行細(xì)胞分裂，不能發(fā)生細(xì)胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 細(xì)胞培養(yǎng)（另外寫細(xì)胞融合、胚胎分割也對，寫了三個(gè)則給滿分）（2）ABD（3）動(dòng)物體細(xì)胞核 （4）血清 溫度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 細(xì)胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可以增殖而不發(fā)生分化
3．生物技術(shù)中的倫理問題
【知識(shí)鏈接】生物技術(shù)引發(fā)的倫理問題包括克隆技術(shù)引發(fā)的倫理問題、試管嬰兒引發(fā)的倫理問題、基因檢測引發(fā)的倫理問題。中國政府對于克隆技術(shù)的態(tài)度是禁止生殖性克隆人，不反對治療性克隆人；對于試管嬰兒的態(tài)度，中國衛(wèi)生部的規(guī)定是實(shí)施體外受精、胚胎移植及衍生技術(shù)必須獲得衛(wèi)生部的批準(zhǔn)證書。
例4下圖所示為人類“治療性克隆”的大致過程。請回答下列問題：
（1）圖中①為 細(xì)胞，過程A是目前實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞克隆的關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)稱為 。
（2）圖中③能誘導(dǎo)分化出神經(jīng)細(xì)胞、血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞，其根本原因是 的結(jié)果。這樣培育得到的組織器官進(jìn)行自體移植的最大好處是 。
（3）若應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療遺傳性糖尿病，可將健康人的控制胰島素合成的基因?qū)虢Y(jié)構(gòu)④中的
，原因是這些細(xì)胞 。
（4）在用PCR技術(shù)擴(kuò)增胰島素基因時(shí)，緩沖溶液中必須加入的物質(zhì)有：、分別與兩條模板鏈結(jié)合的兩種引物、 以及四種脫氧核苷酸。DNA的合成方向總是從子鏈的延伸。
（5）我國政府禁止生殖性克隆，但不反對治療性克隆研究。為什么要反對生殖性克隆（即克隆人）呢？請你寫出一條理由： 。
解析：從圖可以看才出，治療性克隆是將患者的體細(xì)胞的核與卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行重組， 形成重組細(xì)胞，將重組細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)得到囊胚，取囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)得到不同組織器官，可用于進(jìn)行自體移植，不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。
答案：（1）次級(jí)卵母（卵） 核移植
（2）基因選擇性表達(dá)不會(huì)產(chǎn)生排異（免疫排斥）反應(yīng)
篇9
Studies on Specifity Detection of Transdifferentiation of Epidermal Stem Cell to Conjunctival Epithelium
MENG Fanjian1CHEN Jiaqi2
1.Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220, China；2.Zhongshan Ophthalmic Center, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510060，China
[Abstract] Objective To detect the transdifferentiation epidermal stem cells using realtime RT-PCR, and to ensure the feasibility of stem cell treatment on ocular reconstruction. Methods The experimental group cells were co-cultured with the conjunctival epithelial cells as the feeder cells with setting the blank control group. The both groups were cultured for the same time, and after 1, 3, 5, 7 day（s） extracted the RNA and detected the expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 by real-time RT-PCR method. Results Since the third day there were expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 in the experimental group, and on the fifth and seventh day the expression increased significantly（P＜0.01）. Conclusion The transdifferentiation epidermal stem cells in this study possessed the same biological characteristics as the normal conjunctival epithelium.
[Key words] Epidermal stem cell; Conjunctival epithelium; Real-time RT-PCR
表皮干細(xì)胞為皮膚組織中的專能干細(xì)胞，是一種成年組織干細(xì)胞[1]，可增殖分化為表皮中各種細(xì)胞成分，保持皮膚正常的表皮結(jié)構(gòu)。表皮干細(xì)胞的分化方式有兩種：對稱分裂和不對稱分裂。前者分裂成兩個(gè)和母細(xì)胞相同的子代干細(xì)胞；而后者則分裂成一個(gè)子代干細(xì)胞和一個(gè)與母細(xì)胞不同的短暫擴(kuò)增細(xì)胞（TAC）[2]，TAC屬定向祖細(xì)胞。近年來干細(xì)胞療法已成為治療多種疾病的新途徑，可替代、修復(fù)、加強(qiáng)受損的組織或器官的功能[3]。本研究應(yīng)用組織工程學(xué)技術(shù)將表皮干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為結(jié)膜上皮細(xì)胞，通過對目的細(xì)胞生物特性的檢測，探討其在臨床眼表結(jié)膜重建治療中的應(yīng)用前景。
1材料與方法
1.1 材料
1.1.1人皮膚材料包皮標(biāo)本來自中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)患者，無泌尿系統(tǒng)疾病感染，患者年齡18～30歲，所取包皮標(biāo)本均得到患者知情同意。
1.1.2結(jié)膜組織取自尸體眼正常結(jié)膜組織。
1.1.3試劑和儀器PCR用Taq酶采用TaKaRa公司的Ex-Taq；熒光定量試劑盒：SYBR（R） premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）購自TaKaRa公司（美國）；TRIZOL® Reagent RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司（美國）；RNA提取反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自Promega公司（美國）；RoboCycler®Gradient Temperature Cycler PCR儀（Stratagene公司，美國）；MJ Research OpticonTM4熒光定量PCR儀（美國）。
1.2方法
1.2.1飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)取尸體眼結(jié)膜，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍，于無菌超凈臺(tái)剪除結(jié)膜下筋膜組織，將其上皮面向上平鋪于無菌培養(yǎng)皿中，加0.25% Dispase Ⅱ，置于37℃消化2h，棄去消化液并用無菌虹膜恢復(fù)器刮取上皮組織，并加入0.25%胰酶及0.02% EDTA消化約20min，待倒置顯微鏡下見到上皮細(xì)胞充分消化為多個(gè)單細(xì)胞狀態(tài)時(shí)加入上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中止消化，收集細(xì)胞懸浮液，置于離心管內(nèi)，以1500r/min離心5min，獲得消化的結(jié)膜上皮細(xì)胞，將其調(diào)整為1×104個(gè)/mL，在6孔Transwell培養(yǎng)板insert池中加入1mL結(jié)膜上皮細(xì)胞懸液飼養(yǎng)細(xì)胞組為實(shí)驗(yàn)組，對照組insert池中無飼養(yǎng)細(xì)胞，僅為相同體積的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液。
1.2.2表皮干細(xì)胞的分離、篩選、培養(yǎng)取無菌手術(shù)獲得的包皮皮片，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍后用含有1×103U/mL青霉素、2.5mg/L兩性霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液浸泡30min，無菌超凈臺(tái)剪除皮下組織，并剪成2mm×4mm皮條，浸泡于0.25% Dispase Ⅱ，置于4℃過夜。次日用眼科鑷撕取表皮皮片，D-Hank’s液沖洗3次，并用眼科顯微剪將其剪成1mm×1mm碎片，加入0.25%胰酶，37℃消化5～10min，用滴管吹打使細(xì)胞脫落，加入上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中止消化，200目細(xì)胞篩過濾得細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞懸浮液置于離心管內(nèi)，以1500r/min離心5min，獲得消化所得的皮膚上皮細(xì)胞。將其以1×106個(gè)/mL密度接種于Ⅳ型膠原（100μg/mL）鋪底的培養(yǎng)瓶置于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁20min后，去除未貼壁細(xì)胞，加入新的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2d換液一次。
1.2.3表皮干細(xì)胞與結(jié)膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的誘導(dǎo)分化取1～2代表皮干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，以5×106個(gè)/mL接種于6孔Transwell培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)組insert池中加入1mL結(jié)膜上皮細(xì)胞（細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL）作為飼養(yǎng)細(xì)胞；對照組insert池中僅為相同體積的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1、3、5、7d后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，分別取對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞提取RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測目的基因β2-微球蛋白、角蛋白K13的表達(dá)情況。
1.2.4細(xì)胞總RNA的提取吸出6孔Transwell培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入1mL TRIZOL® Reagent，振蕩混勻，15～30℃溫育5min，每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振蕩15s，然后于15～30℃放置2～3min，于2～8℃離心樣品15min（＜12 000g），將上層水相移至新管中，每1mL原始Trizol用量加入0.5mL異丙醇，室溫放置10min，4℃離心（＜12 000g），棄上清，每1mL Trizol用量用1mL 75%乙醇洗滌，振蕩樣品，然后7 500g離心樣品5min（如果用來富集小分子RNA，則不用75%乙醇洗滌，直接進(jìn)入下一步），空氣干燥RNA 10min，用適量RNase free水溶解，于60℃溫育10min，置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.5引物的構(gòu)建按照參考文獻(xiàn)[4]構(gòu)建設(shè)計(jì)：β-actin正向引物：5’-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3’，β-actin反向引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’；β2M正向引物：5’-GAATTGCTATGTGTCTGGGT-3’，β2M反向引物：5’-CATCTTCAAACCTCCATGATG-3’；CK13正向引物：5’-GAGGAATGGTTCCACGCCAAG-3’，CK13反向引物：5’-GCGACCAGAGGCATTAGAGGT-3’。
1.2.6PCR擴(kuò)增取3μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物做模板，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康募尤胂鄳?yīng)的正向引物和反向引物。PCR反應(yīng)總體系為20μL。條件為95℃ 5min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min，1個(gè)循環(huán)。
1.2.7熒光定量PCR按照SYBR（R）Premix Ex TaqTM試劑盒的說明書進(jìn)行。取1μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物做模板，20μL反應(yīng)體系，引物濃度為10nM/μL，各加入0.5μL。SYBR（R）Premix Ex TaqTM 10μL，用雙蒸水補(bǔ)平至20μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 10s，1個(gè)循環(huán)；94℃ 5s，58℃ 31s，讀板，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用2-CT方法。
2結(jié)果
Realtime RT-PCR的結(jié)果見圖1、圖2。結(jié)果可見實(shí)驗(yàn)組表皮干細(xì)胞5d及7d后β2-微球蛋白mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，分別為（300±26）%（P＜0.01）、（300±13）%（P＜0.01）；CK13 mRNA表達(dá)上調(diào)（480±110）%（P＜0.01）、（760±53）%（P＜0.01）。與對照組相比，β2-微球蛋白mRNA及CK13 mRNA表達(dá)都有顯著性上調(diào)。
圖1表皮干細(xì)胞中β2-微球蛋白mRNA的表達(dá)水平5d實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中β2-微球蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)（300±26）%（P＜0.01）；7d實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中β2-微球蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)（300±13）%（P＜0.01），其中n=5，6
圖2表皮干細(xì)胞中CK13 mRNA的表達(dá)水平5d實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CK13 mRNA表達(dá)上調(diào)（480±110）%（P＜0.01）；7d實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CK13 mRNA表達(dá)上調(diào)（760±53）%（P＜0.01），其中n=5，6
3討論
角蛋白（keratin）是上皮細(xì)胞異性的中間絲成分。已知的細(xì)胞中表達(dá)的各種角蛋白家族亞單位成員具有組織特異性，并且和細(xì)胞的分化相關(guān)[5]。例如：Krenzer等[6]報(bào)道：在正常結(jié)膜上皮細(xì)胞中表達(dá)角蛋白K13/K4/K8/K19/K7。Dota等[7]研究報(bào)道：通過對38例正常結(jié)膜組織的上皮細(xì)胞建立的cDNA文庫，檢測出角蛋白K13是結(jié)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中表達(dá)最豐富的基因，且該基因與細(xì)胞骨架的合成有關(guān)，并認(rèn)為K13有可能是有關(guān)眼表結(jié)膜細(xì)胞分化最敏感的基因。而且早期的研究中也證明：在結(jié)膜上皮細(xì)胞的免疫組化鑒定中結(jié)膜上皮細(xì)胞可被特異性角蛋白K13抗體標(biāo)記，而在皮膚干細(xì)胞中并無相應(yīng)抗體的表達(dá)[8]。
β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin）是HLA抗原的成分之一。雖然有關(guān)該種蛋白的功能尚未明確，但是該蛋白存在于淚液中并可能來源于結(jié)膜上皮細(xì)胞中。并且在正常狀態(tài)下淚液中的β2-微球蛋白濃度明顯高于炎癥時(shí)淚液中濃度。Dota等[7]研究中也同時(shí)檢測到β2-微球蛋白也是結(jié)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄較高的基因，因此本研究將CK13和β2-微球蛋白作為結(jié)膜上皮細(xì)胞標(biāo)記性（特異性）的高效表達(dá)基因。
近年來，相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]報(bào)告了通過組織工程技術(shù)將成體干細(xì)胞體外合成生物替代品，并對其組織功能改良用于眼表重建的臨床治療新技術(shù)。然而，成功的眼表重建依賴于兩個(gè)重要因素。其一，具有高分化、高增殖能力的干細(xì)胞；其二，干細(xì)胞的載體組織。本研究中應(yīng)用具有高分化、高增殖能力的表皮干細(xì)胞為種子細(xì)胞，從而保證眼表重建治療中能獲得可靠的細(xì)胞源。我們早期的相關(guān)研究中[4]報(bào)告應(yīng)用同源異體的結(jié)膜去細(xì)胞基質(zhì)膜為干細(xì)胞載體膜，不僅可保證具有良好的組織相容性，而且也確保在體外模擬形成結(jié)膜上皮細(xì)胞增殖的組織微環(huán)境。從而誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞定向分化、增殖。
研究結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)分化的表皮干細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)具有結(jié)膜上皮細(xì)胞的特異性基因CK13及β2-微球蛋白的高表達(dá)，提示該實(shí)驗(yàn)方法可誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞形成特異性短暫擴(kuò)增細(xì)胞（TAC），并能定向分化為類結(jié)膜上皮細(xì)胞。因此，在臨床上眼表重建的干細(xì)胞療法應(yīng)用中，該方法不僅可保證獲得充足的目的細(xì)胞來源，而且確保目的細(xì)胞具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性。在眼表結(jié)膜組織的重建及生理功能恢復(fù)的臨床治療中提供有效的組織來源。但是，該研究方法中誘導(dǎo)分化的表皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞能否合成人工結(jié)膜生物膜活體動(dòng)物眼表的存活狀況及生理功能重塑方面的問題，還需要進(jìn)一步的研究探索。
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篇10
1 無血清培養(yǎng)體系簡介
無血清培養(yǎng)體系是在合成培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，主要是尋找替代血清的各種可能性，使無血清培養(yǎng)既能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，又可以避免血清帶來的不利影響。與含血清培養(yǎng)相比，具有很多的優(yōu)點(diǎn)，無血清培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展是從上世紀(jì)七十年代開始的，其中基于生產(chǎn)安全性的重組藥物而開發(fā)的無血清培養(yǎng)基，不用動(dòng)物做為蛋白來源，降低了成本也加快了報(bào)批的速度，后來逐漸發(fā)展成為培養(yǎng)基的組成成分全部為化學(xué)已知物，更易進(jìn)行目標(biāo)蛋白的分離純化，要求培養(yǎng)的細(xì)胞要具有較高的特異性。
一般無血清培養(yǎng)體系由基礎(chǔ)培養(yǎng)和替代血清補(bǔ)充因子兩部分組成，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)是零添加血清的合成培養(yǎng)基，按照細(xì)胞的生長要求將各種微量元素和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行合成為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。補(bǔ)充因子是代替血清的各種因子，包括激素、生長因子、結(jié)合蛋白等，在所有的補(bǔ)充因子中，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉是細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長所必須的，是必須具備的補(bǔ)充因子。
2 無血清培養(yǎng)體系在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用
2.1 無血清培養(yǎng)基研制配方的應(yīng)用
研究人員研究發(fā)現(xiàn)在無血清合成輸卵管液培養(yǎng)基中加入胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒，可以提高動(dòng)物胚胎的發(fā)育質(zhì)量，再加入牛血清白蛋白后，可以促進(jìn)囊胚的發(fā)展，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)。CHO、Vero等工程細(xì)胞是單克隆抗體和基因工程藥物的表達(dá)載體，在對無血清培養(yǎng)基的研制時(shí)，要滿足增殖的需要，同時(shí)也要表達(dá)目的產(chǎn)物。例如CS-NS0細(xì)胞是抗-CD25單克隆抗體的表達(dá)體，無血清低蛋白培養(yǎng)基可以滿足大規(guī)模培養(yǎng)和抗體表達(dá)的要求，批培養(yǎng)最大活細(xì)胞密度和最大抗體濃度都達(dá)到很高。基于人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)的無蛋白培養(yǎng)基，可以用于對抗聚乙烯介導(dǎo)轉(zhuǎn)染慢病毒，具有較高的滴度，成本也較低。針對Vero細(xì)胞源乙型腦炎疫苗而研制的無血清培養(yǎng)基，沒有任何動(dòng)物源性成分，疫苗只要添加穩(wěn)定劑，就可以在常溫下保存。
2.2 無血清培養(yǎng)體系在細(xì)胞增殖方面的應(yīng)用
雌二醇是無血清培養(yǎng)基中經(jīng)常添加的激素，如果其濃度較高，會(huì)抑制毛囊的生長；PDGF、TGF-β、FGF是三種信號(hào)通路，可以促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞的生長分化，如果其中之一受到抑制作用會(huì)影響間質(zhì)干細(xì)胞的生長，如果三種信號(hào)通路結(jié)合好，則會(huì)使間質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中傳到五代。如果無血清培養(yǎng)基鈣濃度較低，下調(diào)Smad蛋白介導(dǎo)會(huì)維持角膜基質(zhì)細(xì)胞的表型，角膜的上皮細(xì)胞也可以長期進(jìn)行傳代培養(yǎng)。中草藥是我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)代表，細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)也影響到中草藥的作用機(jī)制，研究顯示黃芪可以增加人皮膚表皮干細(xì)胞將粒酶轉(zhuǎn)化為錄酶，并增強(qiáng)其活性。
2.3 無血清培養(yǎng)基在細(xì)胞和組織移植中的應(yīng)用
無血清培養(yǎng)體系安全性較高，所以廣泛應(yīng)用于基于生物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞或組織移植治療中。在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，可以獲得與含血清培養(yǎng)基相同的增殖效果，如果患者屬于特殊貧血類型并且體重較輕，可以誘導(dǎo)人體成骨，并可以抑制異位骨，這方面比含血清培養(yǎng)更具有優(yōu)勢。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可以在無血清培養(yǎng)的條件下抑制細(xì)胞的凋亡，使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以存活于下肢缺血性疾病的治療中。
如果某些細(xì)胞和組織具移植的可能性，如果研制的培養(yǎng)基可以長久的維持細(xì)胞特性，這將會(huì)促進(jìn)移植的成功率。新鮮剛分離的肝細(xì)胞具有特有的分化屬性，此屬性如果存在于含血清培養(yǎng)基中就會(huì)喪失掉，如果在無血清培養(yǎng)基中添加地塞米松、表皮生長因子、垂體提取物等，肝細(xì)胞就會(huì)保持3-4周的分化屬性，這對于需要肝部移植的患者來說，是一大福音。對由幼年牛軟骨外植體組成的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，外植體的力學(xué)性能和生物含量得到了有效的加強(qiáng)，其性能一直比較穩(wěn)定，細(xì)胞充滿活力。含血清基外植體的力學(xué)則有所下降，并且損失了一定的聚糖并發(fā)。這充分說明了無血清培養(yǎng)基可以延長成熟細(xì)胞的特性，在組織互作無血清培養(yǎng)體系中，需要添加特定的材料來介導(dǎo)才能促進(jìn)上皮間質(zhì)的互作。
2.4 無血清培養(yǎng)基在腫瘤治療方面的應(yīng)用
無血清培養(yǎng)基具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括可以使細(xì)胞生存所需的營養(yǎng)物質(zhì)得到保證，除掉了血清中的促分化劑，對于腫瘤的發(fā)現(xiàn)和治療具有重要的應(yīng)用價(jià)值。無血清培養(yǎng)可以增加SP2/0細(xì)胞中的瘤細(xì)胞，這些瘤細(xì)胞都具有干細(xì)胞特性，可以將SP2/0中的腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行富集。細(xì)胞外基質(zhì)可以影響腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和遷移，無血清培養(yǎng)基中加入纖維連接蛋白后來培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞，可以上調(diào)基質(zhì) 金屬蛋白酶的活性。單克隆抗體可以阻斷整合素，可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活化反應(yīng)。在進(jìn)行腫瘤治療時(shí)，對體外誘導(dǎo)擴(kuò)增CIK細(xì)胞及抗腫瘤活性進(jìn)行研究，分別采用無血清培養(yǎng)和含血清培養(yǎng)基，結(jié)果顯示無血清培養(yǎng)基可以代替含血清培養(yǎng)基，某些方面還有含血清培養(yǎng)沒有的優(yōu)勢。研究人員研究了適合于B16黑色毒瘤細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，對樹突狀細(xì)胞進(jìn)行預(yù)防。這說明無血清培養(yǎng)的免疫活性細(xì)胞可以用于腫瘤的生物免疫治療。
2.5 無血清培養(yǎng)基在外周血淋巴細(xì)胞抑制中的應(yīng)用
抑制外周血淋巴細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基是一種生物制劑，主要成分是凝集素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清替代物，其血清替代物包括牛血清白蛋白、重組人胰島素、檸檬酸鐵和氨基酸母液，外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基不用動(dòng)物或者人的血清，不僅降低了培養(yǎng)基成本，還可以降低疾病的傳播，此淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基可以增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)換率，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂，抑制效果顯著，可以廣泛用于染色體核型的臨床診斷，是康復(fù)率低的淋巴疾病的福音。
3 小結(jié)
無血清培養(yǎng)體系具有含血清培養(yǎng)體系無法達(dá)到的優(yōu)勢，但需要在培養(yǎng)通用性、生產(chǎn)高效性以及成本和安全方面進(jìn)行改進(jìn)，未來隨著對細(xì)胞營養(yǎng)、細(xì)胞代謝 、細(xì)胞凋亡以及外源蛋白表達(dá)等的不斷研究，采用更多的科學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，可以使無血清培養(yǎng)基的開發(fā)更加快捷，使模擬細(xì)胞微環(huán)境的無血清培養(yǎng)體系可以廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)領(lǐng)域，特別是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，為更多的疑難雜癥以及再生性疾病提供更多的服務(wù)。
參考文獻(xiàn)
篇11
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) 具有多向分化潛能，可以在體外誘導(dǎo)分化出肝干細(xì)胞，此種骨髓源性肝干細(xì)胞可以為肝組織移植工程提供新的細(xì)胞來源。近年來的研究主要集中于體外誘導(dǎo)MSCs為肝干細(xì)胞，此種細(xì)胞具備了肝細(xì)胞的形態(tài)，在體外能夠表現(xiàn)出一定的肝細(xì)胞功能〔1〕，但對骨髓源性肝干細(xì)胞在體內(nèi)的定居和定位能力情況尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)、分化出肝干細(xì)胞，同時(shí)建立暴發(fā)性大鼠肝衰竭模型，探討骨髓源性肝干細(xì)胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內(nèi)定居情況。
1 材料與方法
1.1 材料
低糖DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝細(xì)胞生長因子（HGF)(CYTOALAB公司)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma公司)；純系SD大鼠、3周齡、體重100～120 g(供體大鼠)和成年純系SD雌性大鼠、體重180～220 g(受體大鼠)，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.2 骨髓源性肝干細(xì)胞培養(yǎng)
1.2.1 MSCs分離、培養(yǎng)及定向肝干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
從供體SD大鼠股骨提取骨髓細(xì)胞。用比重1.073的Percoll分離液行MSCs分離，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)和擴(kuò)增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)誘導(dǎo)定向肝干細(xì)胞分化。
1.2.2 誘導(dǎo)后的骨髓源性肝干細(xì)胞鑒定
用ELASA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫組化法檢測細(xì)胞中細(xì)胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表達(dá)。
1.3 肝損傷動(dòng)物模型的制作和分組
受體雌性SD大鼠20只，隨機(jī)分為正常大鼠組和肝損傷組。肝損傷組用質(zhì)量濃度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔內(nèi)注射，劑量1 200 mg/kg體重。
1.4 同種異體大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞移植
正常組大鼠和肝損傷組大鼠，分別以戊巴比妥麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒、備皮、鋪無菌巾，上腹正中切口，長約1 cm，于肝中葉以BD胰島素注射器注射肝干細(xì)胞懸液0.4 ml（107/ml )，觀察無出血后縫合傷口。
1.5 受體體內(nèi)移植骨髓源性肝干細(xì)胞鑒定
應(yīng)用PCR技術(shù)檢測性別決定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干細(xì)胞移植后1，2，4 w后取受體肝臟移植原位(注射部位)、鄰位(距注射部位0.5 cm)組織，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測〔2〕性別決定因子基因片段(Sry)。引物按文獻(xiàn)〔3〕設(shè)計(jì)，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物對SRY1/ SRY2擴(kuò)增片段大小為317 bp，內(nèi)引物對SRY3/SRY4擴(kuò)增片段大小為121 bp。
2 結(jié) 果
2.1 骨髓源性肝干細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果 大鼠MSCs經(jīng)原代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代，誘導(dǎo)分化，細(xì)胞異形性較誘導(dǎo)前增加，表現(xiàn)為圓形、橢圓形細(xì)胞數(shù)量較誘導(dǎo)前明顯增加，而梭形細(xì)胞數(shù)量減少，誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d左右，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為圓形、橢圓形細(xì)胞為主，梭形細(xì)胞已極少見。免疫組化染色，二氨基聯(lián)苯胺（DAB)顯色，在倒置顯微鏡下，可見細(xì)胞形狀顯圓形或卵圓形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。CK18、CK19、Vimentin呈陽性表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)液中AFP、ALB含量誘導(dǎo)前分別為(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；誘導(dǎo)后分別為(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。誘導(dǎo)后的AFP、ALB含量明顯高于誘導(dǎo)前（P＜0.05)。表明經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs分化為肝干細(xì)胞。見圖1。
2.2 肝損傷模型病理結(jié)果
D氨基半乳糖注射后，大鼠肝臟肝索紊亂，肝細(xì)胞腫脹變性、灶性及大片壞死，伴出血及炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。
2.3 性別決定因子基因片段檢測結(jié)果
肝損傷組：檢測1 w時(shí)陰性，2 w時(shí)原位肝組織Sry陽性表達(dá)，鄰位未表達(dá)，而4 w時(shí)原位及鄰位組織檢測到Sry表達(dá)，原位表達(dá)較2 w時(shí)增強(qiáng)，鄰位較弱。正常肝臟組：1及2 w均未檢測到表達(dá)，4 w時(shí)檢測到原位微弱表達(dá)。見圖3。
3 討 論
MSCs具有多向分化潛能，特別是具有向肝臟干細(xì)胞、肝細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能〔4〕，因而有望成為肝組織移植工程新的種子細(xì)胞來源。由于MSCs是成體干細(xì)胞，取材方便，可以來自患者自身，無排斥反應(yīng)，故具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化為肝干細(xì)胞，對骨髓源性肝干細(xì)胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內(nèi)定居情況進(jìn)行初步研究。
目前研究表明移植肝干細(xì)胞可存活于受體許多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、腸系膜、腎及腎脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝臟由于其獨(dú)特的營養(yǎng)環(huán)境、生理及解剖結(jié)構(gòu)環(huán)境無疑是最理想的場所，可經(jīng)門靜脈輸入或肝實(shí)質(zhì)植入，該組實(shí)驗(yàn)采用肝臟植入方法，取得較好效果，說明此方法是安全可行的。本實(shí)驗(yàn)采用同種異體移植，應(yīng)該考慮免疫排斥反應(yīng)，但文獻(xiàn)報(bào)道，純化的MSCs具有獨(dú)特的免疫原性，進(jìn)行同種異體移植不需要預(yù)先應(yīng)用免疫抑制劑，無免疫排斥反應(yīng)，是良好的基因治療靶細(xì)胞。
目前鑒定受體體內(nèi)被移植后的肝干細(xì)胞有許多方法，其中較為常用的是以雄性動(dòng)物為肝干細(xì)胞供體〔1〕，雌性動(dòng)物接受細(xì)胞移植后，分化增殖的細(xì)胞 Y 染色體陽性，證明雌性受體內(nèi)存活的細(xì)胞來自雄性供體細(xì)胞，這就可以清楚地將植入的細(xì)胞與原有的細(xì)胞區(qū)分開來，進(jìn)一步研究移植作用，本實(shí)驗(yàn)采用雄性供體細(xì)胞為雌性受體移植，檢測移植部位細(xì)胞的Y染色體表達(dá)情況，進(jìn)而檢測移植細(xì)胞是否定植。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位檢測到表達(dá)，4 w表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且臨近部位出現(xiàn)表達(dá)；正常大鼠在移植后4 w移植原位出現(xiàn)微弱表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨髓源性肝干細(xì)胞在正常大鼠肝臟及肝損傷大鼠肝臟內(nèi)均能定居，但在肝損傷大鼠肝臟內(nèi)定居能力明顯增強(qiáng)。考慮可能為大鼠肝損傷后，刺激機(jī)體分泌出各種促進(jìn)肝細(xì)胞再生的生長因子，為移植細(xì)胞提供定居所需的微環(huán)境。文獻(xiàn)報(bào)道，在正常大鼠體內(nèi)，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝損傷時(shí)，啟動(dòng)肝再生程序，這些因子才能被激活，引起肝細(xì)胞有絲分裂。
本文通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞移植后可以定居于受體肝臟內(nèi)，而且在肝損傷后有利于干細(xì)胞移植的定居，這為下一步研究定居于肝內(nèi)的骨髓源性肝干細(xì)胞的功能奠定了基礎(chǔ)。
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篇12
2007年，科學(xué)家利用干細(xì)胞技術(shù)，在培養(yǎng)皿中成功地將皮膚細(xì)胞培養(yǎng)成誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞，這種干細(xì)胞具備類似胚胎干細(xì)胞的功能，能夠根據(jù)需要分化成不同的細(xì)胞。早期的神經(jīng)細(xì)胞培育正是在這種迂回技術(shù)下實(shí)現(xiàn)的，但是由于這種技術(shù)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞不僅轉(zhuǎn)化時(shí)間過長、程序繁雜，而且容易引發(fā)癌癥等風(fēng)險(xiǎn)，所以未能成為成熟的技術(shù)。
2010年，科學(xué)家繞開了誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的繁雜步驟，成功將實(shí)驗(yàn)鼠的皮膚細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上，成功將人體皮膚細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細(xì)胞。
培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的新技術(shù)
篇13
關(guān)鍵詞 毛發(fā)；移植；研究
[中圖分類號(hào)]R737.33[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1674-0742（2015）04（a）-0189-02
[作者簡介]周洪星（1974-），男，四川成都人，大專，主治醫(yī)師，研究方向：致力于FUE-AHT-NFS體系毛發(fā)移植技術(shù)的臨床研究與應(yīng)用。
自19世紀(jì)20年代開始對毛發(fā)移植技術(shù)進(jìn)行研究以來，毛發(fā)外科移植技術(shù)的發(fā)展就方興未艾，其中已經(jīng)應(yīng)用的主要有禿發(fā)頭皮縮減外科、頭皮自體移植技術(shù)以及毛囊單位的移植技術(shù)等。在西方國家，因?yàn)榻萍嫉陌l(fā)展其毛發(fā)移植技術(shù)相對國內(nèi)來說更加先進(jìn)，自體毛發(fā)移植技術(shù)經(jīng)過過去上百年的摸索以及發(fā)展，移植之后毛發(fā)的成活率已經(jīng)得到了顯著的提升且形態(tài)更加接近自然美。
現(xiàn)今，在臨床上所采用的毛發(fā)移植技術(shù)多樣，各方面的技術(shù)手段都有。該文就多年毛發(fā)移植行業(yè)的經(jīng)驗(yàn)對其發(fā)展的現(xiàn)狀以及進(jìn)展等前景做一個(gè)綜述。
1 新型毛發(fā)移植技術(shù)臨床應(yīng)用
1.1 毛發(fā)移植基礎(chǔ)理論
在整形行業(yè)內(nèi)，大多數(shù)學(xué)者還是認(rèn)為“供區(qū)優(yōu)勢理論”是毛發(fā)移植之后所產(chǎn)生的生物學(xué)行為最為主要的。也就是在移植之后毛發(fā)仍然具有在供區(qū)上生長的特性，并且能夠在受區(qū)之內(nèi)長時(shí)間存在。患者在進(jìn)行毛發(fā)移植以后，其移植部位的微生態(tài)環(huán)境可能會(huì)因?yàn)樾坌约に氐乃讲煌l(fā)生改變。大量數(shù)據(jù)研究表明，毛囊干細(xì)胞不僅僅只在毛囊的周期生長之中有著重要的作用，也是表皮進(jìn)行自我修復(fù)和更新的基本來源[1]，這一理論就是現(xiàn)代外科毛發(fā)移植技術(shù)成功的基礎(chǔ)。
現(xiàn)展的毛發(fā)移植手術(shù)最重要的進(jìn)展就是從供區(qū)進(jìn)行切取，然后制備毛發(fā)的皮片并植入受區(qū)內(nèi)微小的移植技術(shù)。“微型毛胚”一般包含有1~2根毛發(fā)；“小型的毛胚”包含有3~4根毛發(fā)，大多數(shù)條型毛胚以及方型毛胚等均屬這一類型。直徑2~4mm毛胚被稱為標(biāo)準(zhǔn)性毛胚，普遍含有7～8根毛發(fā)。
1.2 毛發(fā)自體移植技術(shù)
1.2.1 毛囊單位移植技術(shù)和立體顯微鏡的應(yīng)用 采用十倍雙目放大鏡從全厚的頭皮上自然切取所獲得的成簇毛囊平均存在1~4根毛發(fā)/每簇，然后再借助手術(shù)刀將標(biāo)準(zhǔn)成簇毛囊植入到禿發(fā)區(qū)內(nèi)的針孔，也可以將毛囊簇及周圍存在的皮膚植入到頭皮之上所切的縫隙之內(nèi)。毛囊單位移植技術(shù)的優(yōu)勢就在于能夠得到較高毛發(fā)的密集程度，一次手術(shù)可有使得每平方厘米植入大于60根毛發(fā)。其短處就是手術(shù)以及護(hù)理所需要花費(fèi)的時(shí)間很長。這項(xiàng)研究技術(shù)倡導(dǎo)者認(rèn)為，這項(xiàng)技術(shù)相比于非顯微鏡移植的毛發(fā)損傷比例至少小于20%，但是研究顯示毛囊的橫斷面以及毛球的切除不會(huì)像想象中那么重要。只要毛囊還存在著干細(xì)胞，毛發(fā)就能夠再次生長[2]。這就是爭論的核心觀點(diǎn)。大量研究已經(jīng)證實(shí)，采用顯微鏡能夠少用20%的供區(qū)皮。當(dāng)供選擇的區(qū)域無法足量的時(shí)候，就必須首選顯微鏡制備。
1.2.2 超密度植發(fā) 現(xiàn)今在臨床上已經(jīng)有醫(yī)生傾向于進(jìn)行一次手術(shù)移植大于一千個(gè)以上的微小毛發(fā)皮片段，這就是所謂的“超密度植發(fā)”，進(jìn)行“超密度植發(fā)”能夠使得移植結(jié)果更為迅速且效果更為優(yōu)良。不過這種方式有潛在的醫(yī)學(xué)問題：就是在臨床上，每次手術(shù)都要移植超過600束，而移植600束的時(shí)間大約為4h，移植到1200束則需要6h，這對于醫(yī)生和患者來說都是一個(gè)極其漫長而難熬的過程，醫(yī)生能否堅(jiān)持那么久而不疲勞，患者是否能夠耐受住手術(shù)的長時(shí)間。如果患者的受區(qū)面積較大，或者其頭皮較為腫脹，移植物就可能會(huì)出現(xiàn)壓迫進(jìn)而影響到毛發(fā)生長，供區(qū)的頭發(fā)有一定的概率被全部取完。所以對于毛發(fā)移植手術(shù)來說，手術(shù)的方式以及手術(shù)的對象就顯得極為重要，而且在臨床上還是要考慮留有足夠的供區(qū)頭發(fā)以作為備用。在臨床上采用超密度植發(fā)的時(shí)候需要進(jìn)行技術(shù)評(píng)估，這種方案能實(shí)現(xiàn)更好的治療效果，但是會(huì)存在手術(shù)過程漫長等缺點(diǎn)。
2 組織以及基因工程在毛發(fā)移植技術(shù)方面的應(yīng)用
組織工程以及基因工程對于毛發(fā)移植方面主要能夠彌補(bǔ)患者供區(qū)面積不足，也能夠最大限度地去減少患者的痛苦，實(shí)現(xiàn)毛發(fā)移植的微創(chuàng)，也能夠培養(yǎng)出和受體兼容性更佳的供選擇毛發(fā)。
2.1 毛囊的體外培養(yǎng)與原位細(xì)胞培養(yǎng)
現(xiàn)今存在于毛發(fā)自體移植中，矛盾實(shí)際上就是毛發(fā)需求量大而供區(qū)毛發(fā)量小。這就表明通過組織工程學(xué)進(jìn)行體外毛囊細(xì)胞擴(kuò)增就能夠解決這個(gè)矛盾，而且離體對毛囊進(jìn)行培養(yǎng)也對弄清毛囊生長以及成熟的各方面影響因素有莫大的幫助。現(xiàn)今對于人類毛囊的體外培養(yǎng)技術(shù)也已經(jīng)在技術(shù)上取得成功，不過還是其應(yīng)用到臨床還需要更多的工作去完善。也有學(xué)者提出了“克隆療法”的概念，這種療法在本質(zhì)上來說其實(shí)也就是一種自體細(xì)胞增殖技術(shù)[3]。這個(gè)方法跟體外克隆是一個(gè)道理，就是在患者身上取小塊帶毛發(fā)的頭皮，對毛囊干細(xì)胞進(jìn)行分離然后培養(yǎng)增殖，在所培植的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定級(jí)數(shù)后，再將增殖的皮毛進(jìn)行禿發(fā)區(qū)的移植，這種技術(shù)手段現(xiàn)今已經(jīng)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證并取得成功。不久的將來就可能會(huì)應(yīng)用到人體。這當(dāng)中可能會(huì)用到特制原位細(xì)胞培養(yǎng)基（CCM），這種培養(yǎng)基就是把胰島素以及生長激素等加入到培養(yǎng)基之中制成凝膠，能夠用來外用。原位細(xì)胞培養(yǎng)基主要作用就是加快毛發(fā)的生長并抑制毛發(fā)掉落，其機(jī)制就是通過刺激上皮再生功能。美國學(xué)者Lindenbaum等對以原位細(xì)胞培養(yǎng)基治療的脫毛患者進(jìn)行了隨機(jī)雙盲研究[4]，時(shí)間長為6個(gè)月，顯示以原位細(xì)胞培養(yǎng)基1~3mL，然后封包3個(gè)小時(shí)進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)治療組患者的平均毛發(fā)生長較正常組更優(yōu)，數(shù)據(jù)比較兩組存在明顯差異（P<0.05）
2.2 2脂質(zhì)體毛囊傳遞系統(tǒng)與基因治療
法國學(xué)者多馬申科等在免疫缺陷小鼠身上植入人類的皮膚，在移植物表明應(yīng)用Lipo plex[5-6]。其研究結(jié)果表明，在超過兩千四百個(gè)毛囊為研究對象中發(fā)生轉(zhuǎn)染的細(xì)胞只是毛囊干細(xì)胞，并且在Lipo-plex之前對移植物進(jìn)行拔毛處理以增加轉(zhuǎn)染比例。這個(gè)試驗(yàn)研究表明毛發(fā)生長的初期，采用Lipo-plex可以達(dá)到基因選擇性表達(dá)到干細(xì)胞中并且發(fā)生轉(zhuǎn)染，進(jìn)而影響到毛發(fā)自身的生長特性。這個(gè)試驗(yàn)證明的結(jié)論對于改變毛囊表型并實(shí)現(xiàn)基因治療毛發(fā)疾病理論有著極大的影響，打下了較為可信的基礎(chǔ)研究。在現(xiàn)今，禿發(fā)基因也已經(jīng)被科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)，這個(gè)基因有助于對人類毛發(fā)再生機(jī)制進(jìn)行研究，并開發(fā)出治療禿發(fā)的新途徑。
3 結(jié)語
在此還值得一提的是就是法國一家從事生物技術(shù)的公司最新研發(fā)了Calviron頭發(fā)種植系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)擁有著許多優(yōu)勢[7-9]，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：毛發(fā)獲取的周期短，在手術(shù)室采用刀片組對一直發(fā)片進(jìn)行移植，最多時(shí)能夠在一次手術(shù)取5條發(fā)片。然后將發(fā)片置于自動(dòng)分割器之中，一次性壓取得到超過500個(gè)移植的發(fā)片。如果頭皮條自身的長度超過了10英寸，則采用多次壓取技術(shù)就能夠得到規(guī)格都較為均一的微小發(fā)片，其最大的缺點(diǎn)就是對毛囊沒有精準(zhǔn)的識(shí)別功能，這會(huì)極大地增加手術(shù)對毛囊的破壞作用，并且在手術(shù)前必須進(jìn)行特殊的培訓(xùn)，手術(shù)所用工具為鉆孔手機(jī)，能夠?qū)崿F(xiàn)快速鉆孔。并且控制極為方便，能使得孔徑密度以及大小相互一致。熟練的操作人員能夠在不到15 min打孔到500個(gè)。到現(xiàn)在已經(jīng)存在第二代產(chǎn)品“Omnigraft頭發(fā)種植系統(tǒng)”，其設(shè)備的治療效果更為顯著。
在現(xiàn)今，較為主流的毛發(fā)移植技術(shù)還是以患者自身存在充分供毛區(qū)域?yàn)榍疤岬摹＿@就使得對那些需要移植的面積大或者毛發(fā)完全缺失的患者來說，這種主流毛發(fā)移植技術(shù)就很難展開了。這些治療方法本身都產(chǎn)生新毛發(fā)區(qū)域，也無法達(dá)到增加毛發(fā)數(shù)量的目的。因此，供區(qū)毛發(fā)資源缺失的問題就極為明顯了。這個(gè)矛盾已經(jīng)是現(xiàn)今毛發(fā)移植領(lǐng)域極難解決的問題。許多學(xué)者針對這些問題進(jìn)行多方面研究和考證，在假發(fā)的移植領(lǐng)域，易斌等采用聚丙烯材料頂端固定假發(fā)移植進(jìn)行試驗(yàn)，為臨床的最終應(yīng)用打了良好的基礎(chǔ)。Agrawals在臨床上對治療失敗的10名男性脫發(fā)患者進(jìn)行共聚多酰胺纖維治療[10-11]，每個(gè)人采用1000根纖維，然后在手術(shù)后3年時(shí)間內(nèi)進(jìn)行隨訪，隨訪的患者每年毛發(fā)的掉脫比例低于20%。也有使用尼龍材質(zhì)來作為供發(fā)的報(bào)導(dǎo)，不過這種方式極其容易導(dǎo)致患者出現(xiàn)感染以及排異，導(dǎo)致其在臨床上極少使用，隨著現(xiàn)代材料學(xué)大力發(fā)展，這中方法依然被廣泛關(guān)注，也是現(xiàn)階段較為有效的一個(gè)研究熱點(diǎn)。異體移植的手段現(xiàn)在也是一種被認(rèn)可的治療方式。異體之間的毛囊移植也被強(qiáng)烈關(guān)注。Reynolds等就成功把毛囊的球部進(jìn)行同種異體移植技術(shù)，這個(gè)技術(shù)在最后發(fā)現(xiàn)不會(huì)出現(xiàn)異體免疫的排斥作用。現(xiàn)在大量的研究證據(jù)已經(jīng)證明了嚙齒目動(dòng)物的毛囊間都會(huì)存在或多或少的免疫逃逸。這使得異體毛囊移植技術(shù)在臨床上具有較好的前景。
伴隨著現(xiàn)階段基因以及組織工程技術(shù)方面的大力發(fā)展，許多國內(nèi)外的專家已經(jīng)提出毛發(fā)干細(xì)胞篩選[12]。對人類的毛囊體外培養(yǎng)獲得了巨大成功。不過現(xiàn)今毛囊的離體培養(yǎng)技術(shù)還是有著亟待解決的瓶頸，臨床應(yīng)用還十分的遙遠(yuǎn)。原位干細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)在創(chuàng)傷修復(fù)研究中取得了成功。徐榮祥等認(rèn)為斑禿病患者的毛囊干細(xì)胞發(fā)生萎縮，重啟毛囊干細(xì)胞的復(fù)活就成為毛發(fā)再生的技術(shù)核心。許多研究也已經(jīng)證實(shí)，毛囊干細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)直接下移，或者直接在毛囊的干細(xì)胞地方生長出新的毛囊，濕潤技術(shù)實(shí)際上就是培植毛囊，促進(jìn)局部微循環(huán)的改善。最終生長出正常的毛發(fā)。徐榮祥發(fā)現(xiàn)采用濕潤技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)皮膚的再生愈合，最終發(fā)現(xiàn)成年皮膚干細(xì)胞原位培養(yǎng)對于毛發(fā)治療方面有著較大潛力。這一結(jié)論能夠?yàn)楹竺娴难芯空邘砀玫膯⑹荆つw或者毛囊的干細(xì)胞工程學(xué)的研究也最終必然會(huì)為毛發(fā)移植領(lǐng)域帶來長遠(yuǎn)的意義。不過相比于現(xiàn)今較為成熟的自體移植以及高密度植發(fā)技術(shù)而言，來自基因工程和組織工程方面的技術(shù)手段來相對不成熟，大多數(shù)試驗(yàn)還停留在實(shí)驗(yàn)室的研究階段，即使偶見有臨床報(bào)導(dǎo)那也是極少的個(gè)例，在臨床上大范圍應(yīng)用還有相當(dāng)長的路要走。
參考文獻(xiàn)
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